Qumica Biolgica Patolgica Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas

Química Biológica Patológica Técnicas de Biología Molecular aplicadas a Bioquímica Clínica Equipos Comerciales Tema 5 Dra. Silvia Varas curso. tecmol@gmail. com

¿Qué técnica moleculares se usan en kits comerciales? DOT BLOT REVERSO n MARMS (MULTIPLEX-ARMS) n OLA n

DOT BLOT REVERSO n n n Amplificación por PCR con primers marcados con una molécula de Biotina en el extremo 5’. Después de la PCR los productos de PCR tienen la biotina incorporado en ambas hebras Las sondas o probes se fijan en la membrana por distinto métodos: n n n Fijación a través de colas de Poly (d. T) Fijación a través grupos aminos reactivos Hibridización a los oligos fijados covalentemente a la membrana

nitro-blue tetrazoliumbromo-4 -chloro-3 indolylphosphate 5’ 5 - DOT BLOT REVERSO

OT BLOT REVERSO

LIPA (Line Probe Assay)

Por ej. para la genotipificación del virus de la Hepatitis B: Estas sondas cubren secuencias de los dominios B y C específicas del gen de la polimerasa del HBV

CONTROLES La línea roja es el marcador par una correcta orientación del strip. “Control Conj. ”: control para la adición del reactivo Conjugado/Solución Sustrato. Debe ser positivo y de =intensidad en c/corrida. “Control de Amplificación”: control por la adición de material amplificado para la hibridización. Si hay amplicon sintetizado es (+)

Uso 1

Uso 2

CFTR n Equipo Comercial Italiano

PASOS: n n n Allele-specific oligonucleotide (ASO) probes, complementarios a secuencia de ADN WT y mutantes estan UNIDAS a la membrana (en forma dots o slots). DNA de los pacientes sometido a multiplex-PCR usando primers marcados con biotina se hibridiza con los oligo pegados a la membrana. REVELAR: Estreptavidina-Conjugada FA O CON SISTEMA DE QUIMILUMIN.

Apolipoproteína E: Polimorfismos WT

n Análisis de 28 genotipos

DOT BLOT REVERSO n n n Ejemplo de un kit comercial INNO-Li. PA CFTR 19, INNO-Li. PA CFTR 17+Tn Update; Apo E, (Innogenetics ), Sepsis-ID test (M&D) Ventajas La detección es no radioactiva, confiable, rapida y no requiere un interpretación especializada. Desventajas Relativamente inflexible y no fácilmente expandible para incluir mutaciones o alelos especificos adicionales.

¿Qué técnica moleculares se usan en kits comerciales? n DOT BLOT REVERSO n MARMS (MULTIPLEX-ARMS) Sistema de amplificación refractorio a las mutaciones- múltiples. n OLA

n n n Ampli. Taq Gold: Containing 50% glycerol with buffers designed for enhanced amplification This enzyme is identical to Ampli. Taq Gold® DNA Polymerase but is further purified through a proprietary process to reduce bacterial DNA introduced from the host

29 mutaciones 4 Multiplex: ≈ 7 amplicones

n Se ha observado que la longitud de Poli-T en el intrón 8 esta relacionado a la eficiencia del splicing de los exones que resultan en diferencias del fenotipo que presentan estos pacientes; es importante en hombres que sufren infertilidad por agenesia bilateral congénita los de conductos deferentes (CBAVD) R 117 H positivo investigar estado CBAVD

La cola de politimidina (poli-T) es una cadena de bases de timidina situada en el intrón 8 del gen CFTR y que puede asociarse a trastornos relacionados con el CFTR dependiendo de su tamaño. Las tres variantes comunes de la cola de poli-T son la 5 T, la 7 T y la 9 T

n n La deficiencia de la alfa-1 -antitripsina (A 1 AT) es un trastorno autosómico recesivo que prácticamente solo padecen los caucásicos de ascendencia europea y es la causa genética más frecuente de enfermedad hepática en niños y enfisema pulmonar en adultos. La A 1 AT es un inhibidor de proteasa sérico circulante codificado por el locus PI (símbolo HUGO; SERPINA 1), ubicado en el cromosoma 14 q, que inhibe la actividad de las peptidasas, siendo su principal objetivo la elastasa de neutrófilos, particularmente en las vías respiratorias inferiores

n n n Para la detección de mutaciones del Factor V Leiden (R 506 Q), de la protrombina (factor II 20210 A) y de la metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR C 677 T). Se calcula que la trombosis venosa causa unas 50. 000 muertes anuales en EEUU, con una incidencia anual del 1 por 1000 personas

n n La prueba se compone de dos mezclas de reacción complementarias. Cada mezcla de reacción incluye cebadores que amplifican un control de amplificación interno del ensayo para indicar una amplificación exitosa. N M

¿Qué técnica moleculares se usan en kits comerciales? DOT BLOT REVERSO n MARMS (MULTIPLEX-ARMS) n n x. TAG: ASPE, OLA

OLA (Oligonucleotide Ligation Assay) n n OLA explota la habilidad de la ADN ligasa para unir covalentemente oligonucleótidos adyacentes únicamente cuando ellos son perfectamente complementarias al templado del ADN Dos PASOS: Una amplificación por PCR multiplex n Un ensayo de ligamiento de oligos multiplex n

Ensayo basado sobre captura en Fase Sólida de Sondas Ligadas Variantes: n Detección Colorimétrica en Microplaca n Detección Quimiluminométrica en Microplaca n Detección Fluorométrica en Microesferas n Detección Colorimétrica de Chips Biosensores n

1º PCR 2º Hibridación: 2 tipos de sondas o probes de hibridización - El oligo marcado con digoxigenina o fluoresceina – El oligo alelo específico marcado con biotina

Variante OLA El ADN de la muestra se amplifica y se hibrida con cebadores en una reacción que contenía ADN ligasa y sonda biotinilada. Los productos ligados son capturados en conjuntos de microesferas que expresan en su superficie una secuencia anti-tag.

5’ n 3’ Separados por tamaño y marcado de color

OLA

ASPE ADN de la muestra se amplifica y se hibrida con cebadores en una reacción con ADN polimerasa y d. NTPs (uno marcado con biotina). Los productos extendidas son capturados en esferas que reconocen la secuencia tag de cada conjunto de cebadores. ASPE: allele-specific primer extension= TSPE: target-specific primer extension

ASPE

X-TAG Technology n The PCR products treated with shrimp alkaline phosphatase and exonuclease I (step 2).

n x. TAG - Luminex Corporation

x. TAG Gastrointestinal Pathogen x. TAG® Respiratory Viral Panel (RVP) Cytochrome P 450 2 C 19 (CYP 2 C 19): Clinical Relevance The CYP 2 C 19 gene encodes a member of the cytochrome P 450 superfamily of enzymes known to contribute to the metabolism of many clinically relevant drugs in several therapeutic areas x. TAG GPP can detect agents that can cause Hospital Acquired Infections (HAI) such as C. difficile, foodborne illness agents like E. coli or Salmonella, and common causes of diarrhea in infants and in children 5 years old and younger, such as rotavirus A, Campylobacter, and Shigella. 8 viruses and subtypes: Influenza A, Influenza A subtype H 1, Influenza A subtype H 3, Influenza B, Respiratory Syncytial Virus (RSV), Human Metapneumovirus (h. MVP), Rhinovirus, and Adenovirus