Qumica Biolgica Patolgica ENZIMOPATIAS ERITROCITARIAS IDeficiencia G 6

Química Biológica Patológica ENZIMOPATIAS ERITROCITARIAS I-Deficiencia G 6 PD II- Def. Piruvato Quinasa Tema: 3 (Bolilla 3) Dra. Silvia Varas svaras@unsl. edu. ar

Programa QBP n n TEMA 3: Alteraciones en el metabolismo de hemoglobina: Hemoglobinas estructurales y Talasemias, Consecuencias clínicas y metabólicas, diagnóstico bioquímico y molecular. Mecanismo molecular del defecto genético. Enzimopatías eritrocitarias: deficiencia de piruvatoquinasa y glucosa 6 -fosfato deshidrogenasa.

Deficiencia de Glucosa 6 P-deshidrogenasa Historia

Habas (Vicia faba) 1 - Teoría Tóxica Pitágoras (582 -507 a. C. )

Historia 2º- “teoría alérgica” asociado al consumo de las habas, en un principio no se había asociado a una enfermedad heredable. n 3º-Una tercera etapa fue el reconocimiento de una anemia hemolítica causado por drogas. n

Historia La primaquina es una droga usada para el tratamiento de la malaria. n Se acuño el termino de “primaquina sensible” a los eritrocitos de los individuos con esta deficiencia n

n n El estadio final descubrimiento por Carson y col. (1956) quien demostraron que el defecto metabólico primario en sujetos susceptibles a la primaquina esta asociada a una baja actividad de la G 6 PD en los eritrocitos. Hacia 1958, Gross et al. , por un lado y Szeinberg et al. por otro, determinaron que la deficiencia enzimática tenía una base hereditaria y sugirieron que estaba ligada al sexo.

Gen G-6 PD Hemofilia A Disqueratosis Congénita Ceguera al Color

G 6 PD n En los eritrocitos se encuentra en sus formas dimérica y tetramérica y las dos formas estan en un equilibrio dependiente de p. H, con iguales proporciones a p. H neutro n La actividad catalítica sólo se inicia cuando se establece una asociación en estado de equilibrio entre las formas dimérica y tetramérica. Tal asociación requiere de la presencia de NADP+. n La disminución del p. H provoca un cambio hacia la forma tetramérica Figura Nº 2: Un dímero de glucosa-6 -fosfato deshidrogenada humano. Subunidades A y B son de color rojo y azul. Las moléculas estructurales de NADP+ se dibujan en un modelo y es de color azul oscuro.

Ruta de las Pentosas Fosfato de Oxidación

GSSG: glutathione disulfide (oxidized glutathione) n Reacciones en los eritrocitos en las que se produce y es destoxificado de H 2 O 2

(Anion Exchanger 1)

Oxi. Hb (6 HS) NADH NAD+ Formación Cuerpos Heinz - Meta. Hb (6 HS) + O 2 Superóxido dismutasa Hb sin hem Hemicromo 1 (Reversible) R Hemicromo 2 (Irreversible) H 2 O 2 GSH Cadenas precipitadas Precipita (4 HS) I Cuerpos de Heinz (unido MP) LISIS Catalasa Glutation peroxidasa GSSG H 2 O

n n Un hemicromo se genera cuando el Hem sale del bolsillo que lo contiene y se une a otro sitio de la cadena (quinta posición de coordinación del hierro se une a una fenilalanina proximal (F 8) o la sexta posición de coordinación del hierro se une a una histina distal (E 7)). Hay precipitación intraeritrocitaria y oxidación de los grupos sulfhidrilos de la hemoglobina. Se forman puentes disulfuro entre las cadenas de globina y los –HS de Banda 3. Se observan los cuerpos cocoides unido en la membrana plasmática ocasionando los denominados cuerpos de Heinz, lo cual ocasiona hemólisis intra y extravascular.

Mecanismo Molecular de Lisis La posible secuencia de eventos seria: n Los hemicromos se unen a banda 3, catalizan la oxidación de Banda 3. n Entrecruzamiento oxidativo de Banda 3. n Inmediata asociación con Syk (Spleen tyrosine kinase), fosforilación de treoninas de Banda 3. n La fosforilación marca la disminución de afinidad con la anquirina y liberación del citoesqueleto (espectrina/actina). n Aumenta la movilidad lateral en la bicapa (clustering) de Banda 3. n Formación de agregados de Banda 3. n Progresiva vesiculación. n Perdida de la membrana plasmática y LISIS celular

Clustering Entrecruzamiento Oxidativo AE 1 Fosforilación por Syk Agregados Vesiculación Formación hemicromos n Tomado de: Pantaleo A, Ferru E, Carta F, Mannu F, Simula LF, et al. (2011) Irreversible AE 1 Tyrosine Phosphorylation Leads to Membrane Vesiculation in G 6 PD Deficient Red Cells. PLo. S ONE 6(1): e 15847

Deficiencia de G 6 PD n n G 6 PD deficiencia es un defecto genético hereditario ligado-X. El defecto es causado por mutaciones en el gen G 6 PD, que resulta en variantes de proteína con diferentes niveles de actividad enzimática, Esto esta asociado a una amplia rango de fenotipos clínicos y bioquímicos. La prevalencia global es estimada en 4, 9%, con alrededor de 330 millones de personas afectados en todo el mundo.

Deficiencia de G 6 PD: Variantes n n n De acuerdo con su nivel de actividad, las variantes de la enzima, se agruparon en cinco clases, que son: Clase 1: Deficiencia severa de la enzima con anemia hemolítica crónica no esferocítica (CNSHA). Clase 2: Deficiencia enzimática severa (1 - 10% actividad residual) asociado con anemia hemolítica aguda. Clase 3: Deficiencia enzimática moderada (10% - 60%, actividad residual). Clase 4: Actividad Normal (60%-150%). Clase 5: Actividad enzimática por encima de lo normal ( 150%).

Manifestaciones Clínicas: n 1 -Anemia Hemolitica inducida por drogas n 2 -Anemia Hemolitica inducida por infección n 3 -Favismo n 4 - Bilirrubina Neonatal

1 -Anemia Hemolítica inducida por drogas n Son asintomático hasta la administración de un fármaco.

1 -Anemia Hemolítica inducida por drogas n Cuando ingieren drogas o químicos que desencadenan la hemólisis masiva intravascular n El paciente desarrolla fiebre, orina de color negro(Hemoglobinuria), ictericia y anemia n La necrosis tubular aguda puede complicar el episodio hemolítico severo

instaura el tratamiento

1 -Anemia Hemolítica inducida por infección n n Virus Hepatitis A y B, citomegalovirus, pneumonia, y fiebre tifoidea son causas comunes Una teoría es que la generación de H 2 O 2 por los PMN neutrófilos puede provocar una disminución en la cantidad de glutatión reducido

1 -Anemia Hemolítica inducida por infección n el estrés oxidativo, por lo que disminuye la capacidad protectora de la célula. La necrosis tubular aguda puede complicar el episodio hemolítico severo En algunos pacientes, la coagulación intravascular diseminada (CID), puede ser una complicación

1 y 2 -Anemia Hemolítica: CONSECUENCIAS Fatiga n Dolor de Espalda n Anemia n Ictericia n Bilirrubina No Conjugada y Lactato Deshidrogenasa, n Y Reticulocitosis son los marcadores del desorden. n

3 -Favismo n n n Consumo de habas frescas Las sustancias tóxicas asociadas son Divicina, isouramil y convicina. Manifiesta 24 hs. luego de la ingesta Hemoglobinuria es mas severa que la causada por las crisis hemolíticas producidas por drogas o infección (con Bilirrubina baja). Anemia es generalmente aguda y severa, genera falla renal aguda debido a isquemia o a la precipitación de hemoglobina

4 - Bilirrubina Neonatal n n Cerca de 1/3 de los neonatos varones nacidos con ictericia neonatal tienen deficiencia de G 6 PD La ictericia neonatal puede ser subclínica o llevar al kernicterus, que consiste en daño cerebral y de los nervios auditivos por niveles elevados de bilirrubinemia neonatal no conjugada, y puede llevar a discapacidad intelectual, parálisis cerebral, sordera y muerte.

Bilirrubina Neonatal BLibre= Bilirrubina Libre/ Bilirrubina Total. 100 = 80%

4 - Bilirrubina Neonatal n n Hacer estudios para Def. G 6 PD : A los neonatos (1 -4 días) que desarrollan hiperbilirrubinemia (bilirrubina No Conjugada o Libre (indirecta) concentraciones mayores que 8, 8 mg/dl [150 M/L]) Bilirrubina Indirecta >95%de la Total dentro de las primera 24 h de vida, o en aquellos con antecedentes familiares de hermanos con ictericia

CARACTERÍSTICAS DE LABORATORIO Anemia y reticulocitosis n Cuerpos de Heinz n La presencia de células crenadas o equinocitos n

Control Normal n Deficiencia de G 6 PD El Test de cuerpos de Heinz para la sensibilidad de la primaquina (Deficiencia de G 6 PD).

n Una tinción histoquímica indirecta de los eritrocitos de un paciente heterocigoto para la deficiencia de G 6 PD que sufría de malaria adquirida de forma natural. Las células más pigmentadas son aquellos que contienen actividad normales G 6 PD. Ellos contienen el mayor porcentaje de parásitos de la malaria, como se muestra por las flechas

Diagnóstico Bioquímico: Actividad Enzimática n Medir la actividad enzimática de G 6 PD en eritrocitos, por métodos cuantitativos con análisis espectrofotométrico de la tasa de producción de NADPH a partir de NADP+ a 340 nm.

Diagnóstico Molecular: n n Más del 95% de las mutaciones son mutaciones puntuales que generan mutaciones sin sentido o con cambio de sentido. Las mutaciones generan (+) o desaparecen (-) un sitio de corte para una enzima de restricción. Las mutaciones más comunes (Mediterráneo, A-, Seattle, Unión) pueden ser rápidamente detectadas por amplificación del fragmento de interés seguido de digestión con la enzima de restricción (Mbo. II, Nla. III, Dde. I o Hha. I, respectivamente).

Deficiencia de Piruvato quinasa

Deficiencia de PQ n n PK deficiencia (OMIM 266200) es la causa hereditaria más común de anemia hemolítica no esferocítica (HNSHA) La enfermedad se hereda de forma autosómica recesiva Muestra una distribución en todo el mundo. La prevalencia estimada es de 51 casos por millón (es decir, 1: 20. 000) en la población blanca.

Piruvato Quinasa Deficiencia La mutación 1529 G A es la mas común en USA y en centro y norte de Europa; n La mutación 1456 C T es la que prevalece en el sudeste de Europa (España, Italia, Grecia); n Y la mutación 1468 C T es la mas común en Asia. n

Características Clínicas n n Anemia hemolítica crónica variando en severidad desde asintomática y totalmente compensada a casos con requerimientos de trasfusiones a lo largo de la vida. Grados variables de ictericia suave a moderada esplenomegalia Elevadas concentraciones de 2, 3 -DPG Otros efectos clínicos incluyen retraso del crecimiento, kernicterus, hidropesía fetal, ulceras crónicas en las piernas, pancreatitis aguda secundaria a enfermedad del tracto biliar, sobrecarga de hierro, absceso esplénico, compresión del cordón espinal por tejido hematopoyético extramedular y flebitis migratoria con trombosis arterial esta son raras complicaciones.

Los bajos niveles de hemoglobina pueden ser tolerados debido a una disminución de la afinidad del oxigeno inducido por elevadas concentraciones de 2, 3 -DPG, característica de deficiencia de PK

Hallazgos Hematológicos n n Equinocitos En pacientes con esplenectomía se pueden observar siderocitos, células target, y cuerpos de Howell-Jolly La formación de cuerpos de Heinz incubados puede estar incrementada. Al ser una anemia hemolítica, se observa una disminución en la concentración de haptoglobina e hiperbilirrubinemia indirecta e incremento en la excreción de urobilinógeno fecal. Tinción de células con Azul de. Prusia

n Equinocitos (célula crenada)

Diagnóstico Disminución de la actividad de PK en los eritrocitos. n Los pacientes homocigotas para PK deficiencia la actividad es de un 525% de la observada en un eritrocito normal y n de un 40 -60 % en portadores heterocigotos. n

Bioquímica y Biología Molecular: Isoenzimas Naturales n Las isoenzimas relacionadas a un tejido son generalmente homotetrámeros de subunidades de 50 a 60 k. Da, productos de genes localizados sobre el cromosoma 1 y 15.

n PK-M 2: determinado en el locus 15 q 22, puede ser considerado la isoenzima natural prototipo, es la forma presente en varios tejidos durante la vida fetal temprana. Pero PK-M 2 persiste como la forma principal en leucocitos, plaquetas, pulmón, riñón, bazo, tejido adiposo y como un componente menor en hígado. n PK-M 1: es un producto del mismo locus genético obtenido por splicing alternativo y es la forma predominante en músculo estriado maduro y cerebro. Es la única isoenzima que no esta sometida a modulación por sustrato o cofactor. n PK-L: es la isoenzima natural predominante en hepatocitos esta codificada por un gen en el cromosoma 1 q 21. Es un homotetrámero de subunidades L, cada uno constituido por 543 aminoácidos. n PK-R: es la tercera isoenzima natural, es única en los eritrocitos maduros. Esta bajo control del mismo locus de PK-L, pero es un producto de transcripción distinto con un extremo 5’ distinto, producto de un promotor especifico de tejido

RESUMEN:

Terapia: El tratamiento será sintomático: Transfusiones de eritrocitos cuando los niveles de Hemoglobina han descendido demasiado. n Esplecnotomía en niños con severa anemia, con ello incrementa 1 -3 g/dl los niveles de hemoglobina reduciendo los requerimientos de trasfusiones n

n Alguna pregunta?

Bibliografía general: LEHNINGER ALBERT L. , COX MICHAEL M. , NELSON DAVID L. “Principios de Bioquímica”. Editorial OMEGA 4º Edición. 2006. ü Diapositivas en Power Point (formato ppt) (Manual para docentes) LEHNINGER ALBERT L. , COX MICHAEL M. , NELSON DAVID L. “Principios de Bioquímica” Web: http: //bcs. whfreeman. com/lehninger/ ü The Journal of Biological Chemistry: Classic Articles Web: www. jbc. org ü VOET DONALD, VOET JUDITH G. “Bioquímica” Editorial MÉDICA PANAMERICANA. 3º Edición, en Español. 2006 ü ü WATSON, BAKER, BELL, GANN, LEVINE, LOSICK “Biología Molecular del Gen” Editorial MÉDICA PANAMERICANA. 5º Edición, en Español. 2006 ü STRYER LUBERT, BERG JEREMY M. , TYMOCZKO JOHN L. ”Bioquímica” Editorial REVERTE. Edición 5º Edición, en Español. 2003 ü MATHEWS CHRISTOPHER K. , AHERN KEVIN G. , VAN HOLDE K. E. ”Bioquímica” Editorial PEARSON EDUCACION. 3º Edición en Español. 2003 ü Diapositivas (formato ppt), Problemas (Manual para docentes) y Casos Clínicos de Aplicación VOET DONALD, VOET JUDITH G. and PRATT CHARLOTTE W. “Fundamentals of Biochemistry” Second Edition. Copyright © 2006 by John Wiley & Sons, Inc Web: www. medicapanamericana. com/voet/

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