Quali sono gli strumenti a disposizione dellistologo per

Quali sono gli strumenti a disposizione dell’istologo per lo studio della cellula e dei tessuti?

ordine di grandezza delle strutture di interesse istologico • in questo corso raramente ci soffermeremo sulle esatte dimensioni delle strutture oggetto di studio • è però di fondamentale importanza conoscere l’ordine di grandezza di tali strutture

Cosa significa “ordine di grandezza”? • Semplificando: due oggetti differiscono di un ordine di grandezza quando uno è circa 10 volte più grande dell’altro

quale sarebbe l’esito di Importanza degli ordini di grandezza questo incidente?

può una proteina attraversare la membrana tramite un canale ionico?

scale lineari e scale logaritmiche 8 µm 80 mm 1 mm 7 µm 70 mm 100 µm 60 mm 10 µm 50 mm 1 µm 40 mm 100 nm 3 µm 30 mm 10 nm 2 µm 20 mm 1 nm 1 µm 10 mm 1Å In una scala logaritimica, il valore di ogni suddivisione si ottiene moltiplicando (o dividendo) il valore della suddivisione precedente. In questa scala, il fattore è 10

Questione di dimensioni… 1 mm spessore di un capello umano 100 µm 100 nm cellule epiteliali globuli rossi batteri virus 10 nm proteine 1 nm aminoacidi 1Å atomi le frecce bianche indicano l’ordine di grandezza di alcune strutture biologiche e chimiche

- l’organismo è composto di cellule immagine istologica - esistono molti tipi diversi di cellule

immagine istologica tipicamente, cellule relativamente simili fra loro si aggregano … …formando i cosiddetti tessuti. L’istologia può anche essere definita come lo studio dei tessuti dell’organismo

immagine istologica cosa si osserva?

Anatomia del microscopio ottico o “luce”

bx 51 schema di interior funzionamento di un moderno microscopio ottico

come si ottiene, a partire da tessuti immagine istologica biologici, un’immagine come questa?

La preparazione di materiale istologico Problema 1 • la luce del microscopio può attraversare solo materiale di spessore molto ridotto • il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchi, detti microtomi

microtomo a slitta

microtomi elettronici

La preparazione di materiale istologico Problema 2 • i tessuti biologici sono per lo più molli • prima del taglio, il tessuto deve essere indurito – Fissazione con aldeidi – Inclusione – Congelamento

criostato

La preparazione di materiale istologico Problema 3 • i tessuti sono normalmente quasi incolori e privi di contrasto • prima dell’osservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato • coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica

acidofilia e basofilia • le sostanze acide che si trovano nei tessuti possiedono affinità per i coloranti basici (basofilia) • le sostanze basiche si trovano nei tessuti possiedono affinità per i coloranti acidi (acidofilia o eosinofilia)

diversi tipi di granulociti acidofilo (eosinofilo) basofilo neutrofilo

sequenza dei passaggi in una tipica procedura istologica 1. fissazione di un campione di tessuto in formaldeide 2. congelamento del pezzo 3. taglio al microtomo 4. montaggio su vetrino 5. “bagni” in soluzioni di coloranti 6. disidratazione e coverslipping

lo striscio di sangue Lo “striscio”, una delle tecniche istologiche più diffuse, consente lo studio microscopico delle cellule del sangue e si distingue dal protocollo “generico” appena delineato perché, ovviamente, non richiede il taglio del tessuto.

striscio

Istologia “funzionale” L’istologia moderna non si limita all’osservazione descrittiva degli aspetti morfologici e strutturali di base di cellule e tessuti. Esistono numerose tecniche consentono di rispondere a quesiti su specifici correlati funzionali della composizione di un tessuto • Colture cellulari • Coloranti vitali • Istochimica • Immunoistochimica • Immunofluorescenza • Tecniche speciali – Traccianti assonali – Tecniche combinate

Citochimica e Istochimica • L’identificazione e/o la misura quantitativa mediante reazioni di colorazione specifiche (o mediante metodi fisici) di costituenti chimici delle cellule e dei tessuti Mentre nella biochimica tradizionale il materiale biologico viene studiato tipicamente “in provetta”, la citochimica e l’istochimica applicano tecniche biochimiche direttamente su sezioni di tessuto, consentendo di identificare i costituenti in situ.

Immunofluorescenza e immunoistochimica • Metodi altamente sensibili per la localizzazione di proteine o polisaccaridi nei tessuti • IF: anticorpi coniugati con sostanze fluorescenti • IIC: anticorpi coniugati con enzima perossidasi (rivelato poi da una reazione istochimica)

immagine istologica che livello di dettaglio si apprezza in questa immagine?

stesso tessuto a maggiore ingrandimento

ulteriore ingrandimento. . . è sufficiente il microscopio ottico a “saziare” ogni curiosità sulle strutture viventi?

Questione di dimensioni… 1 mm Occhio umano 100 µm 10 µm Microscopio ottico 1 µm 100 nm le frecce indicano il massimo potere risolutivo di alcuni strumenti di osservazione cell. epiteliali globuli rossi batteri virus 10 nm proteine 1 nm aminoacidi 1Å atomi

Che differenza c’è fra: ingrandimento e potere di risoluzione?

Questo è quello che succede quando si ingrandisce indefinitamente un’immagine.

Aumentare a piacimento la risoluzione di un’immagine già acquisita è possibile solo nei film americani. . .

il potere risolutivo dello strumento di osservazione determina il livello di dettaglio contenuto nell’immagine. L’ingrandimento non determina un aumento di risoluzione delle immagini

di conseguenza, l’ulteriore ingrandimento di questa immagine non rivela maggiori dettagli

. . . e t s i s e a n tr u o f r e p il microscopio elettronico a trasmissione

m. ottico e m. elettronico a confronto

Microscopia elettronica • Preparazione del tessuto – Fissazione in glutaraldeide – Postfissazione in tetrossido di osmio – Disidratazione con alcol – Inclusione in plastiche acriliche o resine epossidiche • Taglio all’ultramicrotomo – Sezioni ultrafini di 20 -40 nm • Aumento del contrasto – Coloranti elettronici come acetato di uranile o citrato di piombo

ultramicrotomo

l’ultramicrotomo produce tipicamente sezioni di 50 -70 nm

Esempio di microscopia elettronica a trasmissione Le immagini di microscopia elettronica sono “in bianco e nero”. Le parti “scure” si dicono elettrondense. L’altissimo potere risolutivo del ME consente di distinguere numerose componenti subcellulari. linfocito

stereomicroscopio • la luce incide sull’oggetto e viene riflessa da esso • si osservano oggetti in rilievo

. . . e h c n a è ’ c i o p Microscopio elettronico a scansione

Microscopio elettronico a scansione • Risoluzione inferiore rispetto alla ME a trasmissione • Consente di valutare il rilievo degli oggetti • Usata per lo studio delle superfici cellulari

Questione di dimensioni… 1 mm Occhio umano l’osservazione di diversi livelli di organizzazione della materia vivente richiede l’uso di diversi strumenti Microscopio ottico 100 µm 100 nm Microscopio elettronico a scansione Microscopio elettronico a trasmissione cell. epiteliali globuli rossi batteri virus 10 nm proteine 1 nm aminoacidi 1Å atomi

capello alcuni esempi di microscopia elettronica a scansione…

formica

ragno

tipi di microscopio Tipo di osservazione Sezioni di tessuto Morfologia esterna Luce visibile Microscopio ottico Stereomicroscopio Elettroni Microscopio elettronico a trasmissione Microscopio elettronico a scansione Fonte di energia