Quale tipo di informazioni possibile ottenere dalla registrazione

Quale tipo di informazioni è possibile ottenere dalla registrazione di correnti di singolo canale?

Ampiezza media della corrente di singolo canale

Ampiezza media della corrente attraverso un singolo canale Chiuso Aperto 1 p. A 20 ms Traccia di corrente attraverso un singolo canale Causa la presenza di un rumore di fondo (thermal noise) che è riducibile ma non eliminabile, l’ampiezza della corrente che fluisce attraverso un singolo canale è soggetta a fluttuazioni. Di essa è pertanto possibile conoscere solo il suo valore medio Il calcolo di tale valore medio richiede la costruzione di un istogramma di ampiezza derivato dalla registrazione di singolo canale

Costruzione di un istogramma di ampiezza Chiuso Aperto 1 p. A 20 ms 1000 Numero degli eventi § Occorre una lunga registrazione di singolo canale § Si misurano le ampiezze di tutte le aperture § Tali ampiezze vengono riportate in un grafico (istogramma di ampiezza) § ll dominio dell’ampiezza (ascissa del grafico) viene suddiviso in intervalli costanti a ciascuno dei quali si associa il numero di aperture aventi ampiezza corrispondente m=2. 0 p. A 800 600 400 200 0 1. 4 1. 6 1. 8 2. 0 2. 2 Ampiezza (p. A) 2. 4 La larghezza dell’istogramma dipende dal rumore di fondo della registrazione L’andamento dell’istogramma può essere descritto da una funzione gaussiana del tipo: dove: m = ampiezza media di corrente s = deviazione standard A = area della distribuzione 2. 6

Misurando le correnti di singolo canale è possibile costruire la relazione I-V a canale aperto -30 m. V -100 m. V L’attività di singolo canale viene misurata nello stesso patch di membrana a diversi potenziali 0 m. V -100 m. V +40 m. V -100 m. V La relazione corrente-voltaggio a canale aperto è generalmente lineare anche nel caso di canali voltaggio-dipendenti iopen single = γ (V-EK) La “conduttanza di singolo canale ( )” è un parametro biofisico che può aiutare a identificare un tipo di canale

Probabilità di apertura

Cos’è la probabilità di apertura? C 1 C 2 C 3 C 4 C 5 C 6 C 7 C 8 C 9 Chiuso Aperto A 1 A 2 A 3 A 4 A 5 vale a dire, A 6 A 7 A 8 A 9 A 10

Tracciati di singolo canale che mostrano Po diverse 0. 1 chiuso aperto 0. 25 chiuso aperto 0. 5 0. 75 0. 9 chiuso aperto

Po nel caso di un canale voltaggio-dipendente: Essa varia al variare del potenziale -60 m. V -100 m. V -30 m. V -100 m. V +40 m. V -100 m. V

Currente, conduttanza, e voltaggio I = N·P·i i = (V – VR) I = corrente “macroscopica” N = numero di canali funzionali P = probabilità che un canale sia aperto i = corrente attraverso un singolo canale aperto = conduttanza del singolo canale aperto V = potenziale di membrana VR = potenziale di inversione 4 i = (V – VR) I = N·P· (V – VR) I = g (V – VR) I (n. A) Corrente = Conduttanza Driving force g = Conduttanza “macroscopica” g = N p se è costante, g è proporzionale a P I = g (V – VR)

Quale altro tipo di informazione può dare l’analisi delle correnti di singolo canale? 1. Il numero degli stati in cui il canale può esistere 2. Il tempo medio di permanenza in ciascun stato 3. Le velocità di transizione tra gli stati

I tre tracciati mostrano la stessa probabilità di apertura ma cinetiche diverse chiuso aperto

Durata delle aperture e delle chiusure Chiuso 1 p. A Aperto 100 ms Traccia di corrente attraverso un singolo canale ottenuta ad un potenziale fisso senza alcun tipo di sollecitazione (stato stazionario). • La corrente passa frequentemente dall’uno all’altro di due distinti livelli • Il canale pur in condizioni stazionarie può trovarsi in almeno due stati conformazionali : chiuso e aperto • La traccia mostra una notevole variabilità nella durata delle aperture e delle chiusure • Non è possibile prevedere quanto tempo il canale rimarrà in ciascun stato funzionale (chiuso o aperto), né quando avverrà la successiva transizione: Siamo di fronte a variabili casuali (stocastiche o markoviane) Le leggi che le governano possono essere dedotte dalla distribuzione di probabilità di un elevato numero di eventi (aperture e chiusure)

Come ricavare la distribuzione di probabilità delle aperture e delle chiusure • Occorre una lunga registrazione di singolo canale • Si misurano le durate di tutte le aperture (e chiusure) • Tali durate vengono riportate in un grafico (istogramma di durata) • ll dominio temporale (ascissa del grafico) viene suddiviso in intervalli costanti a ciascuno dei quali si associa il numero di aperture aventi durata corrispondente Chiuso Aperto 100 ms 500 350 400 250 ∑aperture=950 200 150 100 Numero degli eventi Tempi di chiusura Tempi di apertura 300 ∑chiusure=950 300 200 100 50 0 0 5 10 15 20 25 Durata aperture (ms) 30 20 40 60 80 100 Durata chiusure (ms) 120 140

350 500 Tempi di apertura 400 Numero degli eventi 300 Tempi di chiusura 250 t=8 ms 200 150 100 300 t=26 ms 200 100 50 0 0 5 10 15 20 25 30 20 Durata aperture (ms) 40 60 80 100 120 Durata chiusure (ms) Notare l’andamento decrescente delle due distribuzioni: • gli eventi di breve durata sono i più frequenti • gli eventi più lunghi sono via sempre meno numerosi Le due distribuzioni delle durate sono ben descritte da funzioni del tipo: dove: • N(t) = numero di aperture comprese tra (t-0. 5 dt) e (t+0. 5 dt) • dt =intervallo in cui è suddivisa l’ascissa • a e t sono costanti tipiche del canale In particolare, t =costante di tempo è un indice di quanto rapidamente la distribuzione declina verso zero: t è il tempo a cui la distribuzione è il 37% del suo valore iniziale Nel caso di uno schema cinetico a due stati (C↔O) a=1/t 140

Come sono correlati i tempi di permanenza e le costanti di velocità nel caso di un modello a due stati? C a b O Si può dimostrare che: Cioè: Il tempo medio che il canale trascorre in un particolare stato (il soggiorno in quello stato) e’ il reciproco della costante di velocità di transizione che porta fuori da quello stato. Tempo Medio di Apertura (MOT o to) = 1/b Tempo Medio di Chiusura (MCT o tc) = 1/a Per esempio, se: la durata media dei soggiorni nello stato aperto è to= 1 ms e la durata media di soggiorni nello stato chiuso è tc = 4 ms, Allora: b=1/ to = 1 ms-1 e a=1/ tc = 0. 25 ms-1

Per capirne di più…. Quindi, in uno schema cinetico a 2 stati: MOT=1/b e MCT=1/a La frazione di tempo che il canale trascorre in uno dei due stati (che poi corrisponde alla probabilità P che il canale si trovi in uno dei due stati) dipende da entrambe le costanti di velocità a e b. Pertanto: Fraz. di t nello stato aperto = Po= Se misuriamo un gran numero di tempi di apertura successivi, che tipo di distribuzione osserviamo? Supponiamo che un canale aperto abbia una probabilità P= 0. 3 di chiudersi nei successivi 0. 1 ms. Allora, misurando 1000 aperture, circa 700 volte si avrebbero aperture con un to>0. 1 ms, ecc.

Per capirne di più…. Quando il canale è aperto vi è una probabilità costante che esso cambi il suo stato da O a C in un breve e definito intervallo di tempo dt, indipendentemente da quanto a lungo già si trovava nello stato O, o da come ci era arrivato. Supponiamo per esempio che esista una probabilità P=0. 3 che la transizione avvenga nei successivi 0. 1 ms. Ciò significa che possiamo fare predizioni statistiche circa il cambiamento da O a C. Avendo osservato un gran numero di canali aperti, circa nel 30% di essi il cambiamento a C sarà avvenuto nei primi 0. 1 ms. Quindi, dopo 0. 1 ms il 70% di essi è ancora nello stato O. Nei successivi 0. 1 ms, un ulteriore 30% del rimanente 70% cambierà a C, e così via. Processi con tali caratteristiche, che la probabilità di un particolare cambiamento rimane costante in piccoli intervalli di tempo successivi, sono esempi di processi Markoviani.

Canali con più stati chiusi distinguibili Chiuso Aperto 350 Tempi di apertura 300 Numero aperture 200 150 Numero chiusure Interpolazione con un singolo esponenziale, una costante di tempo 250 t=8 ms 100 50 0 Tempi di chiusura 300 250 Interpolazione con una somma di due esponenziali: due cost di tempo t 1=2. 3 ms a 1=0. 4 t 2=25 ms a 2=0. 6 200 150 100 50 5 10 15 20 25 0 30 10 Durata aperture (ms) 20 30 40 50 60 Durata chiusure (ms) Schemi cinetici possibili: C 1 C 2 O C 1 O C 2 In questo caso le relazioni tra i tempi medi di apertura e di chiusura e le costanti di velocità dipendono dallo schema cinetico scelto

Importanza di: ØFrequenza di campionamento ØFiltraggio dei segnali nella registrazione di correnti di singolo canale Seguiranno esempi di tracciati mostranti la perdita di informazione con una frequenza di campionamento bassa o con un filtraggio eccessivo

Effetto del filtraggio su un tracciato di corrente di singolo canale Traccia filtrata a 10000 Hz Traccia filtrata a 1000 Hz 0. 5 p. A 4 ms In pratica per correnti di singolo canale il filtraggio analogico del segnale è normalmente compreso tra 5 e 3 KHz

Effetto della frequenza di campionamento su un tracciato di corrente di singolo canale Freq. camp. = 0. 1 ms/punto Freq. camp. = 0. 4 ms/punto 0. 5 p. A 4 ms Teorema del campionamento: i dati dovrebbero essere campionati ad una frequenza almeno doppia di quella della banda passante

Molte informazioni sul meccanismo di funzionamento dei canali ionici sono il risultato di una collaborazione tra elettrofisiologi e biologi molecolari Supponiamo per esempio di voler testare l’ipotesi che una particolare catena laterale della proteina-canale sia implicata nel processo di apertura/chiusura.

Mutagenesi Sito-Diretta sul Canale Ionico Gene (DNA) Ipotesi circa una importante catena laterale RNA Viene fatta “esprimere” la proteina con una catena laterale alterata Vengono mutati i codons desiderati o c. DNA misura