QBQ 0102 Educao Fsica Tecnologia do DNA recombinante

QBQ 0102 – Educação Física Tecnologia do DNA recombinante Carlos Hotta 18/06/13

A Tecnologia do DNA recombinante • A tecnologia do DNA recombinante nos permite manipular sequências de DNA e introduzi-las em novos organismos

1975 – Escherichia coli capaz de produzir proteína de Salmonella

Polimerase Chain Reaction

Gel de agarose • O DNA é negativo e é atraído pelo pólo positivo do aparato; • A malha de agarose atrapalha a migração de moléculas maiores, que acabam migrando mais devagar no gel; • O DNA é visualizado com marcadores fluorescentes e o tamanho produzido é estimado com a adição de marcadores com o tamanho conhecido.

Plasmídeos • Plasmídeos são DNA circulares, muito menores que um cromossomos circular, que podem complementar as sequências do genoma da bactéria • Plasmídeos são capazes de se auto-replicar e podem apresentar múltiplas cópias em uma só célula • Plasmídeos geralmente possuem: origem de replicação, um local de múltiplos sítios de restrição, um gene de resistência a antibiótico

Enzimas de restrição cortam o DNA • Enzimas de restrição são endonucleases com capacidade de cortar o DNA em sequências específicas • Geralmente reconhecem palíndromos no DNA • Não nomeadas de acordo com seu organismo de origem -> Escherichia coli

Enzimas de restrição podem gerar pontas coesivas ou pontas cegas

Há centenas de enzimas de restrição diferentes

Ligação

Transformação • Bactérias podem incorporar um plasmídeo por choque térmico ou eletroporação • No choque térmico há a incorporação de DNA após um tratamento rápido a 37 o. C a 42 o. C. • Na eletroporação, um pulso de alta voltagem faz com que a memebrana da bactéria permita a entrada dos plasmídeos.

Mas como usar genes de eucariotos em procariotos?

A transcriptase reversa transforma o RNA em DNA • A transcriptase reversa nos permite tornar o RNA novamente em DNA (c. DNA) • O c. DNA é mais estável que o RNA e pode ser usado em reações de PCR • Geralmente as sequências obtidas são de RNA maduro

Animais e plantas transgênicas • Transgênicos são organismos que tiveram seu genoma alterado utilizando-se a tecnologia do DNA recombinante • A agricultura convencional vêm introduzindo genes novos nos organismos faz anos

Como se gera animais transgênicos?

A Agrobacterium tumefaciens é capaz de tarsnferir sequências definidas para o genoma das plantas

Sequenciamento de DNA usa di-deoxi nucleotídeos

Sequenciamento de DNA usavam 4 reações distintas de replicação

Atualmente usa-se dideoxi nucleotídeos com marcadores fluorescentes • Automatização permite sequenciar 96 sequências por vez, 8 a 12 vezes por dia • 96 x 1000 = 960 mil pb por dia!

Novas técnicas de sequenciamento permitem a obtenção de milhões de sequências simultâneas • Pode-se obter o mesmo número de sequências que no Projeto Genoma em questão de dias • Existem diversas técnicas envolvidas que geram diversos tipos de sequências (de 50 pb a 10000 pb) em diversas quantidades (de milhares a centenas de bilhões) • Como analisar? • A busca é a do genoma humano por U$1000 -> cada pessoa no planeta pode ter seu próprio genoma sequenciado! • Por quê sequenciar?