PRZYDATNO DIAGNOSTYCZNA OZNACZANIA NIEBIAKOWYCH ZWIZKW AZOTOWYCH Maciej piewakowski
PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA OZNACZANIA NIEBIAŁKOWYCH ZWIĄZKÓW AZOTOWYCH Maciej Śpiewakowski III rok OAM
NIEBIAŁKOWE ZWIĄZKI AZOTU Mocznik Kreatynina Kwas moczowy Amoniak
MOCZNIK diamid kwasu węglowego syntetyzowany w wątrobie, usuwany głównie przez nerki swobodnie dyfunduje przez błony komórkowe ok. 40% mocznika przesączonego w kłębuszkach nerkowych ulega resorpcji zwrotnej, a także może być wydzielany w kanalikach nerkowych stanowi ok. 45% azotu pozabiałkowego osocza prawidłowe stężenie w surowicy (10 -50 mg/d. L) – zależy od: - perfuzji nerek i wielkości diurezy (klirensu wolnej wody) - wielkości GFR - szybkości syntezy mocznika – zależy bezpośrednio od podaży białka w diecie i katabolizmu białkowego
OZNACZANIE MOCZNIKA Metoda chemiczna - oparta na reakcji Fearon’a, w której diacetyl kondensuje z mocznikiem tworząc barwną (żółtą) pochodną diazynową absorbującą przy 540 nm - diacetyl jest niestabilny – jest produkowany w środowisku reakcji z diacetymonoksymu w środowisku kwaśnym - ma ograniczoną swoistość (cytrulina i alantoina także dają reakcję dodatnią) - szybko następuje zmniejszenie natężenia barwy - reakcja przebiega w 100°C – okres ogrzewania zależy od stężenia mocznika - nie stosuje się do prawa Lamberta-Beera
OZNACZANIE MOCZNIKA Metoda enzymatyczna - metoda pośrednia – wykorzystuje ureazę hydrolizującą mocznik do CO 2 i NH 4+, który jest następnie oznaczany podczas reakcji Berthelota lub z dehydrogenazą glutaminianową (GLDH): GLDH NH 4+ + α-ketoglutaran + NADH+H+ glutaminian + NAD+ +H 2 O [test optyczny prosty - szybkość zmiany absorbancji przy długości fali 340 nm jest wprost proporcjonalna do stężenia mocznika]
WARTOŚCI REFERENCYJNE MOCZNIKA Ze względów metodycznych wartością oznaczaną jest azot mocznika: BUN (blood urea nitrogen). Przelicznik BUN na stężenie mocznika: 0, 46 (mg/d. L) lub 2, 14 (mmol/L). - zdrowi dorośli: 6 -20 mg/d. L - dorośli powyżej 60 roku życia: 8 -23 mg/d. L - ciężarne i dzieci – lekko obniżone stężenia w stosunku do zdrowych dorosłych - nieco wyższe stężenia u mężczyzn niż u kobiet
MOCZNIK PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA Nieprawidłowe stężenia mocznika Obniżone stężenie mocznika w surowicy: - zaburzenia syntezy mocznika (wyłączone 80 -95% miąższu wątroby) - zmniejszona synteza w wątrobie z towarzyszącym zwiększeniem objętości krwi krążącej (przewodnienie) - stany anaboliczne (stosowanie androgenów) - dieta niskobiałkowa Zwiększone stężenie mocznika w surowicy: - nadprodukcja mocznika (masywny rozpad białek tkankowych lub bogatobiałkowa dieta, resorpcja białek po krwawieniu do przewodu pokarmowego, steroidoterapia, nadczynność tarczycy) - zmniejszenie perfuzji nerek - odwodnienie - terapia tetracyklinami
MOCZNIK PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA Wskazania do oznaczania mocznika w surowicy - różnicowanie przednerkowej i pozanerkowej azotemii (współczynnik mocznik/kreatynina) - nasilenie toksemii mocznicowej u chorych z terminalną niewydolnością nerek - u chorych dializowanych w celu oceny stanu metabolicznego i nasilenia katabolizmu białkowego
KREATYNINA bezwodnik kreatyny występuje we krwi i w moczu powstaje w organizmie w wyniku nieenzymatycznego rozpadu fosforanu kreatyny jest wydalana z organizmu wraz z moczem (średnio wydala się tak ok. 14 -26 mg kreatyniny na kilogram masy ciała) stanowi jeden z markerów biochemicznych pozwalającym monitorować stan nerek
OZNACZANIE KREATYNINY Metody chemiczne Reakcja Jaffego - kreatynina reaguje z pikrynianem w środowisku alkalicznym tworząc pomarańczowo -czerwony związek kompleksowy (490 -500 nm) - mało swoista reakcja - dodatnią reakcję Jaffego dają: kwas askorbinowy, glukoza, ciała ketonowe (interferują najsilniej – gł. acetooctan), białka, pirogronian - interferuje ujemnie bilirubina – dodanie surfaktantu i stosowanie buforów boranowego lub fosforanowego podczas reakcji, zmniejsza ten wpływ. Metody enzymatyczne
WARTOŚCI REFERENCYJNE KREATYNINY Zależne od zastosowanej metody; dla metody Jaffego: - mężczyźni: 0, 9 -1, 3 mg/d. L (80 -115 mmol/L) - kobiety: 0, 6 -1, 1 mg/d. L (53 -97 mmol/L) Współczynnik przeliczeniowy z mg/d. L na mmol/L: 88, 4 Wydalanie kreatyniny z moczem: - mężczyźni: 14 -26 mg/kg/24 h (124 -230 mmol/kg/24 h) - kobiety: 11 -20 mg/kg/24 h (97 -177 mmol/kg/24 h)
KREATYNINA PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA Nieprawidłowe stężenia kreatyniny Zwiększone stężenie kreatyniny Przy prawidłowa funkcja nerek: - odwodnienie - akromegalia Przy ostrej niewydolności nerek: - przednerkowa (wstrząs hipowolemiczny, kardiogenny, septyczny, anafilaktyczny) - nerkowa (toksyczne/alergiczne działanie leków, środki cieniujące, mioliza, hemoliza, szpiczak, metale ciężkie, posocznica, rzucawka ciężarnych, choroby układowe, szybko postępujące kłębuszkowe zapalenie nerek) - pozanerkowa (zatrzymanie moczu, narkotyki) Przy przewlekłej niewydolność nerek: kłębuszkowe zapalenie nerek, śródmiąższowe zapalenie nerek, nefropatia cukrzycowa, nadciśnienie tętnicze, choroby tkanki łącznej, nerka szpiczakowa)
KREATYNINA PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA Obniżenie stężenia kreatyniny we krwi nie występuje często. Jego przyczyną może być głodówka, zanik mięśni lub stosowanie kortykosteroidów. Może wystąpić także podczas ciąży. Stosunek stężenia mocznika do kreatyniny w surowicy krwi (prawidłowo 12 – 20) służy do oceny funkcji nerek; pozwala określić, czy występują stany kataboliczne, odwodnienie albo czy stosowana jest dieta wysokobiałkowa.
KWAS MOCZOWY główny produkt katabolizmu puryn - puryny dostarczane z dietą (ok. 300 mg/24 h) - katabolizm endogennych kwasów nukleinowych synteza kwasu moczowego: ok. 400 mg/24 h w nerkach kwas moczowy jest: - filtrowany w kłębuszkach nerkowych - w 98 -100% resorbowany w cewkach proksymalnych krętych - następnie wydzielany do światła kanalików w części dystalnej kanalików proksymalnych - resorbowany w cewkach dystalnych 6 -12% kwasu moczowego przefiltrowanego w kłębuszkach jest wydalone z moczem.
OZNACZANIE KWASU MOCZOWEGO Metoda chemiczna Metoda z kwasem fosforowolframowym (PTA) - wykorzystuje właściwości redukujące kwasu moczowego - PTA w środowisku alkalicznym ulega redukcji pod wpływem kwasu moczowego – powstaje barwny związek (650 -700 nm) - wiele substancji interferuje w tej reakcji
OZNACZANIE KWASU MOCZOWEGO Metoda enzymatyczna Metoda z urykazą - urykaza katalizuje utlenienie kwasu moczowego do alantoiny, czemu towarzyszy produkcja H 2 O 2 i CO 2 - guanina, ksantyna i kilka innych analogów kwasu moczowego może interferować w tej reakcji (musiałyby występować w stężeniach nie spotykanych w próbkach biologicznych) - pomiar: - w stanie równowagi (po zakończeniu inkubacji) - pomiar kinetyczny – spadek absorbancji przy 293 nm
OZNACZANIE KWASU MOCZOWEGO Metoda z urykazą sprzężona z układem peroksydazy z użyciem jednego z wielu akceptorów tlenu i wytworzeniem barwnego chromogenu: - 4 -aminofenazon z substytutem fenolu = sulfonianem phydroksybenzenowym (reakcja Trindera = peroksydaza/fenol/4 -a minoantypiryna) – 546 nm - hydrazon 3 -metylo-1 -benzotiazoliny (MBTH) - 2, 2’-azyno-di(3 -etylo-benzotiazolino)-6 -siarczan (ABTS) - o-dianizydyna substancje interferujące: - kwas askorbinowy (dodaje się oksydazę askorbinianową) - bilirubina (dodaje się ferrocyjanid)
OZNACZANIE KWASU MOCZOWEGO Metoda z zastosowaniem HPLC - metoda referencyjna - chromatografia jonowymienna lub odwrotnej fazy (RP) - detektor spektrofotometryczny – 293 nm (detekcja kwasu moczowego w eluencie) - czas retencji dla kwasu moczowego: do 6 minut Proponowana metoda definitywna oznaczania kwasu moczowego to metoda rozcieńczeń izotopowych sprzężona ze spektrometrią masową (ID-MS).
WARTOŚCI REFERENCYJNE KWASU MOCZOWEGO Dla metod enzymatycznych: - mężczyźni: 3, 5 -7, 2 mg/d. L (0, 208 -0, 428 mmol/L) - kobiety: 2, 6 -6, 0 mg/d. L (0, 155 -0, 357 mmol/L) stężenie kwasu moczowego: - zwiększa się wraz z wiekiem – ok. 10% pomiędzy 20 i 60 rokiem życia - zwiększa się u kobiet po menopauzie (osiągają stężenia takie jak u mężczyzn) - w ciąży stężenie kwasu moczowego zmniejsza się w ciągu pierwszego trymestru i utrzymuje się do 24 tygodnia ciąży, kiedy zaczyna się zwiększać nawet do poziomu wyższego niż przed ciążą Współczynnik przeliczeniowy z mg/d. L na mmol/L: 0, 06
KWAS MOCZOWY PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA Nieprawidłowe stężenia kwasu moczowego Hipourykemie (stężenie kwasu moczowego w surowicy < 2 mg/d. L) - leki (allopurinol, salicylany, estrogeny, fenylobutazon) - radiologiczne środki cieniujące - niewydolność wątroby - tubulopatie (zmniejszona resorpcja)
KWAS MOCZOWY PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA Hiperurykemie (stężenie kwasu moczowego >7 mg/d. L u mężczyzn i >6 mg/d. L u kobiet) - spowodowane zwiększoną syntezą kwasu moczowego - pierwotne - idiopatyczne - dziedziczne choroby metaboliczne - wtórne - zbyt duża podaż z dietą - nasilony obrót metaboliczny puryn np. w białaczkach, szpiczaku, - alkohol
KWAS MOCZOWY PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA Hiperurykemie (stężenie kwasu moczowego - spowodowane zmniejszonym wydalaniem kwasu moczowego - pierwotne (idiopatyczne) - wtórne - ostre i przewlekłe choroby nerek - zwiększona resorpcja w nerkach - zmniejszone wydzielanie w nerkach - zatrucie ołowiem
AMONIAK źródła: - z glutaminy, glutaminianu, alaniny transportowanych do przewodu pokarmowego, wątroby i nerek - syntetyzowany w przewodzie pokarmowym przy udziale flory bakteryjnej jelit - wbudowywany do mocznika w cyklu mocznikowym przy fizjologicznym p. H 7, 4 amoniak występuje głównie w postaci zjonizowanej nie przechodzącej przez barierę krew-mózg. W przypadku zasadowicy wzrasta stężenie postaci niezjonizowanej, przechodzącej do mózgu i przez zwiększającej ryzyko wystąpienia encefalopatii w nerkach amoniak uczestniczy w utrzymaniu równowagi kwasowozasadowej oraz wpływa na zasoby sodu i potasu w organizmie
OZNACZANIE AMONIAKU Metoda pośrednia - 2 etapy Etap 1 - przeprowadzenie NH 4+ w NH 3: techniką dyfuzji izotermalnej lub przy użyciu żywic kationowymiennych (wymiana a następnie eucja) Etap 2 - oznaczenie NH 4+ - metoda Nesslera - metoda Berthelota Metoda bezpośrednia – enzymatyczna GLDH NH 4+ + α-ketoglutaran + NADH+H+ glutaminian + NAD+ +H 2 O
WARTOŚCI REFERENCYJNE AMONIAKU Wartości referencyjne stężenia amoniaku wyrażone jako azot (N) w amoniaku - noworodki : 64 -107 mmol/L (90 -150 mg N/d. L) - niemowlęta: 21 -50 mmol/L (29 -70 mg N/d. L) - dorośli: 15 -45 mmol/L (11 -32 mg N/d. L) Stężenie amoniaku w erytrocytach: 100 -330 mg N/d. L Współczynnik przeliczeniowy z mmol/L na mg N/d. L: 1, 41 z mg N/d. L na mmol/L: 0, 714
AMONIAK PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA Zwiększone stężenie amoniaku we krwi Przyczyny wątrobowe: - marskość wątroby - ostra niewydolność wątroby - zapalenie wątroby - zespół Reye’a - wrodzone bloki enzymatyczne - zmniejszenie lub brak aktywności enzymów cyklu mocznikowego Czynniki pozawątrobowe przy współistniejącym uszkodzeniu wątroby: znaczne obciążenie białkiem przewodu pokarmowego, zakażenia, alkohol, hipokaliemia, zasadowica metaboliczna, zaburzone wydalanie nerkowe
DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ
- Slides: 27