Protena recombinante Lactamasa Tecnologa de DNA recombinante Herramientas

Proteína recombinante β-Lactamasa

Tecnología de DNA recombinante: Herramientas

c. DNA

Inducción a las proteínas recombinantes Las proteínas recombinantes se obtienen a partir de una especie o una línea celular distinta a la célula original. Ventajas de expresar proteínas recombinantes en bacterias: fácil de cultivar fácil de modificar genéticamente trabajo rápido alto rendimiento (80%) ahorro de $$$$$ Retos de expresar genes de eucariontes en bacteria. . . Estructura terciaria y cuaternaria modificaciones post-traduccionales Incompatibilidad de codones. . depende de la complejidad de la proteína

Clonación del DNA • DNA foráneo (secuencia que se desea clonar) Vector híbrido o recombinante • Vector de clonación (vehículo) • Organismo huésped • (E. coli) Ajuste de condiciones 7

OPERON LAC

Vector de clonación p. ET-24 a(+)

Selección de bacterias transformadas

• Un gene siempre tiene que ir flanqueado por una zona promotora y otra de paro de la transcripción

El sistema de expresión también debe tener las siguientes características: Cromosoma de Escherichia coli

El vector PET tiene la secuencia del promotor T 7 y de Lac. O cerca de la secuencia del transgene

Análogos de la lactosa

Diferencias entre DH 5 alfa y BL 21(DE 3) • DH 5 alfa: tiene al gen rec. A mutado, por lo que no puede realizar recombinaci{on heteróloga (asugura la estabilidad del inserto). Carece de algunas endonucleasas, impidiendo la digestión del plásmido. Esta cepa es competente para la seliección de colonias azules y blancas. • BL 21. Deficiente en algunas proteasas, degrada menos a las proteínas recombinantes. Emplea a la RNA polimerasa T 7 (cepa DE 3) que se induce con IPTG.

Problemas…

BL 21

Inducción

Procedimiento Tomar 2. 5 m. L de precultivo de E. coli transformado con vector, añadir a 15 m. L de LB (17. 5 m. L) Incubar con agitación a 37 C hasta OD 600 0. 6 -0. 8 Tomar T 0 (1 m. L) e inducir con IPTG 0. 5 ó 1 m. M (final) Continuar incubando. Tomar alícuotas (1 m. L) cada 30 min por 2 h. Después de cada toma centrifugar y guardar sobrenadante (!!!) Tomar 18 µL y mezclar con 12 µL de BC, desnaturalizar (10 min a 95 C). Correr en SDS-PAGE.

Peculiaridades de la construcción: • En vector p. ET-TEM se insertaron genes que codifican para dos proteínas: • 1) β-lactamasa • 2) Omp. A: Proteína de tránsito que se inserta en la membrana externa de las bacterias. (Pag. 43 del manual) • Por lo tanto: no se requiere la extracción de la β-lactamasa, esta será secretada al medio tras su síntesis

Purificación de la proteína recombinante

RESULTADOS DEL ALGÚN SEMESTRE EN EL PASADO…. 2 h 1. 5 h 1 h 0 Después de la inducción

Proteina GFP

Purificación de la proteína recombinante https: //www. youtube. com/watch? v=r 2 P 1 S_U 3_p. A