Protena recombinante bLactamasa Tecnologa de DNA recombinante Herramientas

Proteína recombinante b-Lactamasa

Tecnología de DNA recombinante: Herramientas

c. DNA

Inducción a las proteínas recombinantes Las proteínas recombinantes se obtienen a partir de una especie o una línea celular distinta a la célula original. Ventajas de expresar proteínas recombinantes en bacterias: fácil de cultivar fácil de modificar genéticamente trabajo rápido alto rendimiento 80% ahorro de $$$$$ Retos de expresar genes de eucariontes en bacteria. . . Estructura terciaria y cuaternaria modificaciones post-traduccionales. . depende de la complejidad de la proteína

Sistemas biológicos de producción de PR • Bacterias – E. coli – B. subtilis • Células eucariontes – Hongos • Levaduras – Saccharomyces cerevisiae – Pichia pastoris y otros metilotróficos • Hongos filamentosos – Células animales en cultivo – Células de insecto en cultivo – Plantas Maximizar la expresión de proteínas codificadas por genes clonados

Clonación del DNA • DNA foráneo (secuencia que se desea clonar) Vector híbrido o recombinante • Vector de clonación (vehículo) • Organismo huésped (E. coli) Ajuste de condiciones 8

Vector de clonación p. ET-24 a(+)

Selección de bacterias transformadas

Vector de recombinación p. ET- TEM-1 7200 bp

• Un gene siempre tiene que ir flanqueado por una zona promotora y otra de paro de la transcripción

El sistema de expresión también debe tener las siguientes características: Cromosoma de Escherichia coli

Además el vector PET tiene la secuencia del promotor T 7 y de Lac. O cerca de la secuencia del transgene

Análogos de la lactosa

Procedimiento Tomar 2. 5 m. L de precultivo de E. coli transformado con vector, añadir a 15 m. L de LB (17. 5 m. L) Incubar con agitación a 37 C hasta OD 600 0. 6 -0. 8 Tomar T 0 (1 m. L) e inducir con IPTG 1 m. M (final) Continuar incubando. Tomar alícuotas (1 m. L) cada 30 min por 2 h. Después de cada toma centrifugar y guardar sobrenadante Tomar 15 µL y mezclar con 10 µL de BC, desnaturalizar y correr en SDS-PAGE.

Peculiaridades de la construcción: • En vector p. ET-TEM se insertaron genes que codifican para dos proteínas: • 1) β-lactamasa • 2) Omp. A: Proteína de tránsito que se inserta en la membrana externa de las bacterias. (Pag. 43 del manual) • Por lo tanto: no se requiere la extracción de la β-lactamasa, esta será secretada al medio tras su síntesis

Purificación de la proteína recombinante

Proteina GFP

Purificación de la proteína recombinante

RESULTADOS DEL ALGÚN SEMESTRE EN EL PASADO…. 2 h 1. 5 h 1 h 0 Después de la inducción