Protena purificada Cristales Difraccin de rayos X Obtencin

Proteína purificada Cristales Difracción de rayos X Obtención de fases Mapa de densidad electrónica Construcción de modelo Refinamiento Validación

Por qué necesitamos cristales para ver difracción? • Amplificación de la señal …. (efecto de interferencia a tener en cuenta!) cristal molécula celda unidad

Difracción: Cada electrón dispersa Las ondas emitidas se suman … y se restan!! El resultado final depende de las fases relativas de las ondas adicionadas en cada dirección Ley de Bragg : n = 2 d sin Usar el sitio interactivo http: //www. journey. sunysb. edu/ Project. Java/Bragg/home. html

Difracción: ondas en fase 1. Cuándo dispersan en fase dos ó más ondas? Cuando recorren la misma trayectoria … como en el fenómeno de la reflexión de luz

Difracción: ondas en fase 2 Cuándo dispersan en fase dos ó más ondas? Cuando sus trayectorias difieren por un múltiplo de la longitud de onda � = 2 d sin … como en el fenómeno de la difracción de luz

Difracción: ondas en fase Cuanto mayor es el ángulo de difracción, más pequeño es el espaciamiento para el que la difracción es sensible � = 2 d sin / � = 1 / d Cambiando la dirección del haz entrante Mirando diferentes planos en el cristal

Difracción: ondas en fase Qué clase de información obtenemos de esto? ~posición relativa de los centros dispersores (scatterers), esto es, los átomos, en la direcci� ón perpendicular a los planos considerados En la dirección del ángulo negro va a registrarse baja intensidad difractada según el rojo, mayor Por qué?

Cuándo vemos difracción de un cristal? • Un cristal amplifica la difracción en ciertas direcciones, aquéllas para las que la totalidad de las celdas unidad dispersan en fase… • y las elimina en las otras direcciones • Antes que nada: sólo planos repetitivos pueden dispersar en fase debido a la simetría del cristal (repetici� ón de la celda), esos planos tienen relaciones enteras con los ejes de la celda!!

Cuándo vemos difracción de un cristal? a b c : los tres ejes de la celda unidad Los planos de Bragg conectan divisiones enteras de cada eje plano 1 0 0 plano 3 0 0

Cuándo vemos difracción de un cristal? Ahora mirando diferentes orientaciones en 2 dimensiones plano 1 1 0 plano 2 1 0 plano 1 -1 0 Indices de Miller h k l

Resolución Grado de detalle

detalle distancia entre planos ordenados del cristal

El límite de resolución en proteínas • Si los átomos estuvieran quietos y el orden cristalino fuera perfecto, la resolución estaría limitada sólo por la • E������� í�a� este no es el caso : desorden, alto contenido de solvente (~50%), flexibilidad…. • 4 Å mala • 3 Å más o menos • 2 -2. 5 Å razonable • 1. 5 Å muy buena • <1 Å excepcional

La difracción ocurre en el espacio recíproco Si cualquier punto en el cristal puede ser definido como un vector tridimensional r = xa + yb + zc entonces, la difracción ocurre en un espacio recíproco de manera que s = ha* + kb* + lc* Cada eje de esta celda recíproca queda definido teniendo una dirección perpendicular a los otros dos ejes del espacio real y una longitud igual a la recíproca del espaciamiento entre los planos definidos por dichos ejes

Espacio recíproco Construcción de la esfera de Ewald

Espacio recíproco de un verdadero cristal de proteína…

Teoría de Fourier El patrón de difracción está relacionado al objeto que difractó las ondas, a través de una operación matemática denominada transformada de Fourier

Teoría de Fourier El patrón de difracción está relacionado al objeto que difractó las ondas, a través de una operación matemática denominada transformada de Fourier

Teoría de Fourier El patrón de difracción está relacionado al objeto que difractó las ondas, a través de una operación matemática denominada transformada de Fourier Importante! Esta integral puede invertirse…. Atención a F, es un vector!

El problema de las fases Dado que Fhkl es un vector, tiene una magnitud Y una fase (se comporta como una onda!) Fhkl 2 es directamente proporcional a la intensidad medida Ihkl …pero la información sobre se perdió!

Soluciones al problema de las fases : • Hipótesis (re)emplazo molecular estructura ≈ conocida • Perturbar la estructura (y con ella la difracción) Reemplazo isomorfo Difracción anómala

Fitting y refinamiento Con la densidad electrónica proyectada en una estación gráfica, uno tiene que construir un modelo atómico que • encaje bien en la densidad • tenga sentido químico y físico Este modelo predice un patrón de difracción (a través de una transformada de Fourier inversa), y uno usa luego programas para minimizar la diferencia entre las amplitudes Fhkl calculadas y observadas

Construyendo el primer modelo Los mapas de densidad electrónica son el resultado final del experimento de difracción. Su interpretación en términos de un modelo molecular es la primer tarea del cristalográfo

Construyendo el primer modelo Con lo que el problema de fitear un modelo se asemeja al de 'no perder de vista los árboles en el bosque' esqueletonización

Construyendo el primer modelo

Construyendo el primer modelo 1. Con estos mapas esqueletonizados, lo primero es trazar la cadena principal (ayuda: los C están a ~3. 8 Å unos de otros!) 2. Luego, se ajustan las cadenas laterales

Validación de modelos Chequear la geometría del modelo construido: parámetros estereoquímicos, distancias y ángulos de enlace, ángulos dihedros permitidos, etc, etc. Gráfico de Ramachandran de ángulos dihedros y f

Lisozima «made in Uruguay» : 1. 4Å resolución Rwork=15. 1% Rfree=18. 2% Fases experimentales!! (solvent flattened SAD) Dispersión anómala de los S and Cl-, a la Cu K (1. 542Å)

Estructura de un represor transcripcional (Fap. R) : MAD (1 Se/21 k. Da) + DM Protein cleaved during purification/storage!! 50 m. M Tris p. H 8. 5, 10 m. M Mg. Cl 2, 15% PEG 4000 P 41212, a=b=59. 1 Å, c=157. 8 Å, resol: 3. 5 Å

Estructura 3 D de Fap. R 0 min 1 min 50 m. M Tris p. H 8. 5, 10 m. M Mg. Cl 2, 15% PEG 4000 P 41212, a=b=59. 1 Å, c=157. 8 Å, resol: 3. 5 Å 5 min Soaking de Mal-Co. A

Complejo Fap. R 43 - malonil-Co. A Schujman et al. , EMBO J, 2006

Buenos sitios www para ver : http: //www-structmed. cimr. cam. ac. uk/course. html http: //www-structure. llnl. gov/Xray/101 index. html http: //www. yorvic. york. ac. uk/~cowtan/index. html Buenos libros para leer : T. L. Blundell & L. N. Johnson (1976), "Protein Crystallography", Academic Press: London. Jan Drenth (2007), "Principles of Protein X-ray Crystallography", 3 rd edition. Springer-Verlag: New York. D. Sherwood (1976), "Crystals, X-rays and Proteins", Longman: London.

Muchas gracias!

Conceptos básicos de difracción: ondas, interferencia y espacio recíproco Qué son los Rx? Fotones = propagados como una onda E t amplitud (fase) longitud de onda E(t) = A cos(wt + ) w=2 p�

Ondas Qué son los Rx? Fotones = propagados como una onda E x amplitud (fase) longitud de onda E(x) = A cos(wx + ) w=2 p

Ondas Si combinamos la variación en el espacio y en el tiempo A cos[2 p(nt-x/ )] efectos “opuestos” del tiempo y la distancia

Adición de ondas Sumando el valor del campo eléctrico para cada punto t… + …da el campo total en t = La suma de dos ondas con longitud de onda siempre produce una onda resultante de long de onda . “interferencia constructiva”: la amplitud aumenta.

Interferencia destructiva + Diferencia de fase = 180° = La amplitud disminuye

Sumando ondas como vectores Si queremos sumar todas las ondas dispersadas por el elctron e- de una proteína, usando expresiones de la función de onda obtenemos operaciones trigonométricas MUY feas… A cos( +f 1) + B cos( +f 2) + … Dado que tenemos dos tipos de información (variables) en cada onda, mplitud y fase, podemos usar la notación de vectores para facilitar las operaciones Imaginar una rotación const. del vector 1; y graficar el cos o el sin de

Sumando ondas como vectores Ahora la adición y sustracción se vuelven una operación geométrica simple

Algunas disgresiones matemáticas… Este formalismo usando números complejos en lugar de vectores "simples", es de enorme utilidad! Las ondas pueden siempre separarse en sus componentes de ondas simples coseno y seno E(t) = A cos(wt + ) Usando la regla de la suma de ángulos: A cos(wt + ) = A coswt - A sinwt amplitud del componente coseno amplitud del componente seno

Algunas disgresiones matemáticas… E(t) = A cos(wt + ) Usando la regla de la suma de ángulos: A cos(wt + ) = A coswt - A sinwt amplitud del componente coseno i A amplitud del componente seno r Ahora las ondas pueden ser sumadas sumando los dos componentes: real e imaginario.

Algunas disgresiones matemáticas… Los números complejos son del tipo z = a + ib donde i = √-1 Diagram de Argand (plano complejo) La rotación en el plano complejo es posible por multiplicación de vectores √i = 45°

Con lo que, A cos(wt + ) = A coswt - A sinwt, para wt constante puede escribirse A cos + i A sin ó aun, A e i ������ = fase z 1 z 2 = |z 1| exp(i 1) |z 2| exp(i 2) = |z 1||z 2| exp[i( 1 + 2)]

Algunas disgresiones matemáticas… Teorema de Euler La suma del coseno de más i veces el seno de es el número e elevado a i veces .