Proteine globulari Enzimi Mioglobine ed emoglobina Trasportatori Enzimi

Proteine globulari • Enzimi • Mioglobine ed emoglobina • Trasportatori

Enzimi

Definizioni • Gli enzimi sono proteine la cui attività catalitica dipende dall’integrità della loro conformazione nativa. • Praticamente tutte le reazioni biochimiche sono catalizzate da enzimi. • Sono catalizzatori molto efficaci che aumentano la velocità delle loro reazioni di vari ordini di grandezza (107 – 1014)

Cofattori • Alcuni enzimi non hanno bisogno di altri gruppi chimici per la loro attività se non quelli dei loro residui aminoacidici. • Altri invece hanno bisogno di componenti chimici addizionali chiamati COFATTORI. • Il cofattore può essere: a) uno o più ioni inorganici (Fe, Mg, Mn, Zn)→ metallo proteine. b) molecole organiche complesse legate non covalentemente→ coenzima. c) molecole organiche complesse o ioni metallici legati covalentemente alla proteina enzimatica→ gruppo prostetico

• L’oloenzima è un enzima cataliticamente attivo con tutti i suoi cofattori. • L’apoenzima o apoproteina è la parte proteica di un enzima. • Gli isoenzimi sono enzimi esistenti in forme molecolari diverse catalizzanti lo stesso tipo di reazione.

Classificazione degli enzimi • Gli enzimi vengono classificati in base alla reazione che catalizzano: 1. 2. 3. 4. Ossidoreduttasi (trasferimento di elettroni) Transferasi (reazioni di trasferimento di gruppi) Idrolasi (reazione di idrolisi) Liasi (addizione di gruppi a legami doppi o formazione di doppi legami mediante rimozioni di gruppi) Isomerasi (trasferimento di gruppi all’interno di molecole formando isomeri) Ligasi (formazione di legami C-C, C-S, C-O, C-N, mediante reazioni di condensazione accoppiate alla scissione di ATP) 5. 6.

Catalisi enzimatica La funzione di un catalizzatore è quella di aumentare la velocità della reazione senza modificare gli equilibri: es. A ↔ B Allo stato basale, le molecole A e B contengono una quantità caratteristica di energia libera. Tra A e B esiste una barriera energetica che corrisponde all’energia necessaria ad allineare i gruppi reagenti, a formare cariche transitorie instabili, a riorganizzare i legami e ad altre informazioni che sono richieste perché la reazione possa procedere in una delle due direzioni. Per far avvenire la reazione, le molecole devono superare questa barriera e raggiungere un livello energetico più alto. Allo stato di transizione (punto più elevato della curva) la molecola ha le stesse probabilità di decadere verso A o B. Lo stato di transizione è un momento molecolare transitorio in cui alcuni eventi (rottura di legami, comparsa di cariche…) devono procedere fino a quel punto preciso in cui il composto può ritornare substrato o diventare prodotto

La differenza tra i livelli di energia dello stato di base e dello stato di transizione viene detta energia di attivazione (ΔG**). Il catalizzatore aumenta la velocità di reazione abbassando l’energia di attivazione. Un enzima può catalizzare sia in direzione A verso B che in direzione opposta, B verso A. Il suo ruolo è quello di accelerare l’interconversione tra A e B. L’enzima non viene consumato durante questo processo e il punto di equilibrio resta inalterato

Cinetica enzimatica • E’ lo studio della velocità della reazione e di come varia in funzione della modificazione di parametri sperimentali. • Cinetica di Michaelis-Menten (cinetica dello stato stazionario): l’enzima prima si combina con il substrato, si forma il complesso enzima-substrato che poi si decompone nel prodotto e nell’enzima libero: E + S → EP → E + P Equazione di Michaelis-Menten: equaz. della velocita’ di una reazione catalizzata da un enzima con un solo substrato V 0= Vmax [S] Km+ [S] Vmax Km [S] velocità di catalisi massima dell’enzima. costante di Michaelis concentrazione di substrato

Interazioni enzima-sustrato E + S → EP → E + P

Km, costante di dissociazione • Km è definita come la concentrazione di substrato a cui V 0 è metà della Vmax: Vmax =Vmax[S] 2 Km+[S] Dividendo per Vmax si ottiene: 1 = [S] 2 Km+[S] Risolvendo per Km si ha: Km+[S]=2[S] →Km=[S] • E’ una caratteristica di ogni reazione enzimatica e rappresenta una misura dell’affinità dell’enzima per il substrato: minore è il valore della Km, maggiore è l’affinità.

Relazione tra concentrazione del substrato e velocità iniziale per 2 enzimi ( a e b) agenti sullo stesso substrato • L’enzima a ha una Km più elevata (minore affinità per il substrato) e produce la Vmax a concentrazioni di substrato più elevate; • L’enzima b ha un valore di Km più basso e raggiunge la Vmax a concentrazioni di substrato più basse (maggiore affinità per il substrato). • La reazione catalizzata dall’enzima b è pertanto favorita da basse concentrazioni di [S], quella catalizzata dall’enzima a è favorita da concentrazioni elevate di [S].

Interazioni enzima-sustrato • L’enzima per poter catalizzare una reazione deve essere in grado di poter interagire con il proprio substrato. • Gli enzimi sono molto specifici e possono discriminare tra molecole molto simili. • I gruppi catalitici di un enzima interagiscono con il substrato e lo preparano (attivano) alla reazione. • L’energia richiesta per abbassare l’energia di attivazione deriva in genere da interazioni deboli non covalenti (energia di legame) che si formano tra substrato e enzima nel sito attivo. • Queste interazioni tra enzimi e substrato sono ottimali nello stato di transizione e rappresentano la maggiore forza trainante della catalisi.

Interazioni enzima-sustrato: idrolisi del saccarosio da parte della saccarasi

Specificità degli enzimi • La specificità si riferisce alla capacità di un enzima di discriminare tra composti simili. • Essa deriva dalla formazione di una molteplicità di interazioni deboli tra l’enzima e praticamente tutte le parti della molecola del suo substrato specifico a livello del sito attivo.

Sono stati proposti due modelli di interazione fra enzima e substrato: Modello chiave-serratura: il sito attivo dell’enzima si adatta al substrato come una chiave in una serratura. Modello dell’adattamento indotto: sia l’enzima che il substrato vengono distorti quando si legano tra loro, il substrato viene forzato ad assumere una conformazione vicina allo stato di transizione.

Interazioni tra substrato e sito attivo: carbossipeptidasi A

Meccanismi di catalisi enzimatica • Sono i meccanismi chimici con cui gli enzimi convertono i substrati in prodotti. • I principali meccanismi di catalisi enzimatica sono: 1. Catalisi acido-basica generale 2. Catalisi covalente 3. Catalisi da ioni metallici

Catalisi acido-basica generale • L’enzima stabilizza gli intermedi carichi che si formano allo stato di attivazione mediante il trasferimento di un protone al o dal substrato per formare specie chimiche si convertono nei prodotti molto più facilmente. • La catalisi a cui partecipano solo H+ o solo OHpresenti nell’acqua viene chiamata catalisi acida o basica specifica.

Catalisi covalente • Coinvolge la formazione di uno o più legami covalenti transitori tra l’enzima e il substrato. • Il legame covalente si forma tra substrato e gruppi funzionali di cofattori o catene laterali di aminoacidi dell’enzima e può attivare il substrato a promuovere una reazione specifica e dipendente dal gruppo chimico o coenzima che vi partecipa.

Catalisi da ioni metallici • I metalli legati all’enzima o assunti dalla soluzione con il substrato possono partecipare alla catalisi. • Le interazioniche tra un enzima con un metallo legato e il substrato possono aiutare a orientare il substrato per la reazione e/o a stabilizzare stati di transizione carichi.

Gli inibitori enzimatici • Gli enzimi possono essere inibiti reversibilmente e irreversibilmente; le sostanze che riducono l’attività enzimatica sono dette inibitori. • • Inibizione reversibile: I. R. competitiva I. R. non competitiva I. R. mista • Inibizione irreversibile

Inibizione reversibile Competitiva: inibitore e substrato competono per lo stesso sito attivo di un enzima e la reazione non può avvenire se si lega l’inibitore perché impedisce il legame al substrato. L’inibizione può essere rimossa aumentando la concentrazione di substrato. Mista: l’inibitore si lega ad un sito diverso da quello del substrato, ma si lega solo al complesso enzimasubstrato (variazione di Vmax e Km). Non competitiva: l’inibitore si lega ad un sito distinto da quello del substrato, e non interferisce con il legame del substrato, che si può legare, ma non viene convertito in prodotti perché l’enzima è inattivo.

Inibizione competitiva Un inibitore competitivo riduce quindi la concentrazione di enzima libero disponibile per legare il substrato. Per elevate [S] la velocità dell’enzima si avvicina alla Vmax annullando l’effetto dell’inibitore, quindi si ha un aumento della Km (riduzione di affinità) ma non della Vmax.

Inibizione non competitiva L’inibitore provoca una distorsione nel sito attivo rendendo così l’enzima cataliticamente inattivo. L’inibitore influisce sull’attività catalitica dell’enzima ma non sul legame tra sito attivo ed enzima, quindi si ha una riduzione della Vmax senza modificare la Km dell’enzima.

Inibizione irreversibile • Gli inibitori irreversibili sono molecole che si combinano covalentemente o distruggono un gruppo funzionale dell’enzima, essenziale per la sua attività catalitica. • Una classe speciale sono gli inibitori suicidi; sono in grado di interagire con il sito attivo dell’enzima trasformandosi in un composto altamente reattivo che si combina irreversibilmente con l’enzima. Vengono chiamati anche inattivatori basati sul meccanismo.

La regolazione enzimatica • In ogni sistema o via metabolica c’è un enzima che regola la velocità complessiva della sequenza di reazioni in quanto catalizza la reazione più lenta o quella che limita la velocità del sistema. • Questi enzimi, chiamati enzimi regolatori, presentano un’attività catalitica aumentata o diminuita in risposta a certi segnali. • L’attività degli enzimi regolatori è modulata mediante vari tipi di segnali: v Modulazione allosterica (enzimi allosterici) v Modulazione covalente reversibile (es. fosforilazioni del gruppo –OH di serine, treonine o tirosine) v Regolazione da parte di proteine di controllo a cui si legano gli enzimi v Attivazione per proteolisi (zimogeni, irreversibile) v Induzione o repressione della sintesi degli enzimi

Modulazione allosterica • I modulatori allosterici sono molecole che possono essere inibitori o attivatori dell’enzima stesso. • I modulatori presentano siti di interazione specifici diversi dal sito attivo chiamati siti allosterici ed apportano delle modifiche conformazionali all’enzima che lo rendono più o meno affine verso il substrato e ne modulano l’attività di catalisi.

Caratteristiche dei modulatori • Lo stesso substrato è spesso un attivatore (modulatore) dell’enzima che viene chiamato omotropico. • Se il modulatore è una molecola diversa dal substrato, l’enzima viene detto eterotropico. • In alcuni sistemi multienzimatici l’enzima regolatore viene inibito dal prodotto finale della via, quando questo si accumula oltre il fabbisogno, il meccanismo viene chiamato: inibizione retroattiva o a feedback. A→B→C→D→E→F

Regolazione da parte di proteine di controllo a cui si legano gli enzimi L'inibitore pancreatico bovino della tripsina forma un complesso stabile con l'enzima tripsina inibendone l'attività proteolitica nel pancreas.

Modulazione covalente reversibile: fosforilazione del gruppo –OH di serine, treonine o tirosine • Molti enzimi possono essere regolati mediante fosforilazione e defosforilazione di alcuni residui di serina, treonina e tirosina presenti nella catena polipeptidica. • Questa modificazione covalente induce nella proteine una variazione di conformazione che può aumentare o inibire l’attività catalitica dell’enzima.

Attivazione per proteolisi • Molti enzimi sono prodotti e immagazzinati come precursori inattivi detti proenzimi o zimogeni • Gli zimogeni sono convertiti in enzimi attivi per idrolisi irreversibile di uno o più legami peptidici. Es: • Chimotripsinogeno (pancreas) chimitripsina (intestino) • Tripsinogeno (pancreas) tripsina (intestino) • Pepsina (pepsinogeno), elastasi (proelastasi), carbossipeptidasi (procarbossipeptidasi), trombina (protrombina)

Induzione e repressione della sintesi • Le cellule possono regolare la velocità di catalisi modificando la velocità di sintesi dell’enzima. • L’aumento (induzione) o la diminuzione (repressione) della produzione di enzima determina una variazione della popolazione complessiva di siti attivi. • Variazioni dell’espressione di sintesi dell’enzima richiedono ore o giorni. • Questo tipo di regolazione è rivolta a enzimi necessari in un determinato stadio dello sviluppo o in particolari condizioni fisiologiche.

Gli enzimi nella diagnosi clinica • Nel plasma sono presenti due gruppi di enzimi: 1) enzimi attivamente secreti nel plasma (es. zimogeni secreti del fegato per la coagulazione). 2) enzimi liberati durante il ricambio cellulare e non attivi nel plasma. • La concentrazione del secondo gruppo di enzimi è costante in quanto la velocità di rilascio dalle cellule danneggiate è controbilanciata da un’eguale velocità di eliminazione dal plasma. • Un aumento di concentrazione di questi enzimi può essere indice di un danno tissutale.

Alcuni esempi: • ALT (alanina amminotransferasi): danno epatico • GGT (g-glutammil-transferasi): danno epatico o vie biliari • CK (creatina chinasi) e LDH (lattato deidrogenasi) isoenzimi cardiaci, GOT (glutammato-ossalacetato transaminasi): infarto del miocardio • CK : distrofia muscolare

Quesiti 1) Quale ruolo hanno i Cofattori enzimatici e quali tipi si conoscono? 2) Che ruolo svolge un Coenzima? Indicare almeno 3 esempi di coenzimi e la rispettiva reazione mediata. 3) Classificazione degli enzimi 4) Quali sono gli aspetti fondamentali della catalisi enzimatica 5) A che cosa si riferisce l’equazione di Michaelis-Menten e quale è il significato della Km in questa equazione? 6) Quali sono i Modelli usati per descrivere l’interazione Enzima-Substrato 3) Attraverso quali meccanismi chimici gli enzimi operano la trasformazione substratoprodotto? 4) Quali sono le principali differenze tra inibizione enzimatica di tipo reversibile e irreversibile? 5) Nel caso di una inibizione reversibile di tipo non competitivo, l’attività enzimatica può essere ripristinata aumentando la concentrazione di substrato? Motivate la vostra risposta. 6) Quale è il meccanismo di azione degli inibitori suicidi? 7) Definire che cosa si intende per enzima regolatore di una via metabolica. Attraverso quali meccanismi può essere modulata la loro azione? 8) Che cosa sono i siti allosterici di un enzima? 9) La fosforilazione dei residui Serinici di un enzima quale tipo di modulazione rappresenta? 10) Indicare almeno due enzimi di importanza diagnostica.