Protein Synthesis Translation and Posttranslational Modifications 2557 3

Protein Synthesis : Translation and Posttranslational Modifications รชนกร กลลประวทธ 2557

3 ปจจยทใชในการสงเคราะ หโปรตน L-amino acid t-RNA Genetic code Aminoacyl-t. RNA synthetase ribosome

Amino acid 4

Transfer RNA (t. RNA) 6

Genetic code 8 First position U C A G U UUC UUA UUG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG Phe Leu lle Met Val UCU UCC UCA UCG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG GCU GCC GCA GCG C A UAU Tyr UAC Ser UAA UAG STOP CAU His Pro CAC CAA Gln CAG AAU Asn Thr AAC AAA Lys AAG GAU Asp Ala GAC GAA Glu GAG G UGU Cys UGC UGA STOP UGG Trp CGU CGC Arg CGA CGG AGU Ser AGC AGA Arg AGG GGU GGC Gly GGA GGG U C A G Third position Second position

Gene mutation & protein synthesis 11 Regulatory element mutation : ทำใหการเกด เปลยนแปลง (เพมขน /ลดลง) สงผลใหปรมาณของโปรตนเปลยนไป Structural gene mutation : ทำใหเกดการเปลยนแปลงตาง Missense mutation Nonsense mutation Chain termination (sense) mutation Splicing mutation Silent mutation Frameshift mutation ๆ ดงน transcription

Structural gene mutation 12 Missense mutation : โปรตนมกรดอะมโนเปลยนไป CAU (His) CAG (Gln) Nonsense mutation : โปรตนสนลง polypeptide chain) CGA (Arg) UGA (stop) Sense mutation : โปรตนยาวขน UAA (stop) UAC (Tyr) (truncated

Structural gene mutation 13 Silent mutation AAA (Lys) AAG (Lys) Frameshift mutation Pro Normal 5' Gln Trp Ser Arg His CCA CAG UGG AGU C GA C A U U Mutant 5' CCA CAG UGG A AG U CG A CAU (base insertion ) Pro Gln Trp Lys Ser Thr 3′ 3′

Ribosome 16 ตำแหนงทเกดการสงเคราะหโปรตน ประกอบดวย 2 subunits (small & large subunit) large subunit ประกอบดวย P site : เปนบรเวณทเกดสาย polypeptide A site : เปนบรเวณท aa-t. RNA มาเกาะ Prokaryotic ribosome : 70 S (50 S & 30 S) Eukaryotic ribosome : 80 S (60 S & 40 S)

Process of translation 17 Initiation Elongation Termination

Initiation 18 การ identify จดเรมตนของ coding sequence บน m. RNA (ซงกคอ codon AUG ตวแรกจากดาน 5’) ปจจยทใชในขนตอน initiation m. RNA Met-t. RNA (ใน prokaryote ใช formyl methionyl-t. RNA) ribosome initiation factors (IF) GTP ATP

Process of initiation (eukaryotes) 19 e. IF 2 a จบกบ complex GTP และ Met-t. RNAi ไดเปน ternary Ribosome แยกเปน 2 subunit โดย 40 S subunit รวมกบ e. IF 3, ternary complex และ e. IF 4 c ไดเปน e. IF 2 a. Mett. RNAi. GTP, e. IF 3. 40 S, e. IF 4 c complex นจะจบ m. RNA ทางดาน 5’ ไดเปน preinitiation complex ซงตองอาศย ATP และ IF ในการอานรหสจากดาน 5’ ไปดาน 3’ จนถง codon AUG ชดแรก

Process of initiation (eukaryotes) 20 anticodon ของ t. RNA เกด base pairing กบ AUG ของ m. RNA ทำให GTP ถกเปลยนเปน GDP IF ตาง ๆ และ GDP ถกปลอยออกมา และ 60 S subunit ของ ribosome เขามารวม เกดเปน initiation complex

21

Process of initiation (prokaryotes) 22 มลำดบของพวรนนวคลโอไทดทเรยกวา Shine-Dalgarno sequence อยประมาณ 10 นวคลโอไทด ทางดาน upstream ของ AUG IF ตาง ๆ นอยกวา 5' ใน eukaryote AUG 3' m. RNA Prok. Shine-Dalgarno sequence ( 10 nt. upstream ของ AUG ) initiation complex อยท P site ของ ribosome

Elongation 23 เกดขนหลงการเกด initiation complex ribosome จะตอสาย peptide ใหยาวขนโดยการอาน codon บน m. RNA ไปเรอย ๆ จนถง termination codon ปจจยทใช คอ initiation complex aminoacyl-t. RNA ทรวมกบ elongation factors (EF) GTP e. EF 1α และ GTP เปน complex

Process of elongation 26

Termination 27 เกดเมอ ribosome สงเคราะห peptide จนมาถง termination codon (UAA, UAG หรอ UGA) e. RF และ GTP จะจบท A site ปลอย deacylated t. RNA จาก E site ปลอย peptide ทสงเคราะหไดออกจาก ribosome

Process of termination 28

29 Energy requirement for protein synthesis Aminoacylation of t. RNA ATP AMP + Ppi Binding of Met-t. RNAi to P site Aminoacyl-t. RNA binding to A site Translocation Termination

Polyribosome 31

Inhibitors of protein synthesis 32 affect on prokaryotes : streptomycin, tetracycline, chloramphenicol & erythromycin affect on eukayotes : cycloheximide & diphtheria toxin affect both prokaryotes & eukaryotes : puromycin

Inhibitors of protein synthesis 33 Inhibitors Mechanism of action streptomycin binds to 30 s ribosomal subunit, preventing formation of the initiation complex tetracycline binds to 30 s ribosomal subunit, inhibits binding of aa-t RNA to A site chloramphenicol inhibits peptidyl transferase activity of 50 s ribosomal subunit erythromycin binds to 50 s ribosomal subunit, prevents translocation cycloheximide inhibits peptidyl transferase in eukaryotes diphtheria toxin inhibit translocation of peptidyl-t. RNA from A to P site puromycin prematurely terminates synthesis

Protein folding 35 mutation บางชนด ทำใหการเกด protein folding ผดปกตไป และทำใหโปรตนดงกลาวไมสามารถถกสงออกจาก ER ได ตวอยางเชน abnormal mutation α 1 -antiprotease foldingของ of α 1 -antiprotease (ทำหนาทเปน elastase inhibitor) retention of α 1 -antiprotease within hepatocyte elastase activity ในปอดสงขน lung destruction

Protein translocation (protein targeting) 36 การเคลอนยายโปรตนจากบรเวณทสงเคราะหไปย งบรเวณทโปรตนทำงาน แบงไดเปน 2 กลม 1. Post-translational translocation 2. Cotranslational translocation

Cotranslational translocation 39

Intracellular protein degradation 42 การสลายโปรตนในเซลล ATP dependent proteolysis เกดขนใน โดยอาศยโปรตน ubiquitin proteasomes Lysosome degradation Other proteolytic systems - Apoptosis หรอทเรยกวา programmed cell death อาศยเอนไซม caspases - Calcium-dependent thiol proteases ทเรยกวา calpains

44 Ubiquitin-ATP dependent protein degradation

Lysosome degradation 46

Proteolytic cleavage 48 การเปลยน zymogen เปน enzyme ทออกฤทธได trypsinogen trypsin factor XII การเปลยน proinsulin factor XIIa prohormone เปน hormone insulin pro-opiomelanocortin (POMC) ACTH + MSH + β-endorphin

N-linked glycosylation 54 เปนการเตม asparagine dolichol phosphate บน amide group ของ เกดท membrane ของ ER มผลตอการเกด protein folding ถกยบยงดวย bacitracin และ tunicamycin

N-linked glycosylation 55 High mannose complex hybrid

O-linked glycosylation 56 เปนการเตมนำตาลเขากบ threonine –OH group ของ serine หรอ เปน post-translational process โดยเกดขนหลงจากทโปรตนไปถง ตวอยางเชน Golgi body ABO blood group antigen H antigen A antigen B antigen

58 Collagen synthesis

Collagen synthesis 61 Collagen fibril ประกอบดวย monomer คอ tropocollagen หลายโมเลกลทเชอมกนโดยการเกด cross-link Tropocollagen แตละโมเลกลประกอบดวย สาย พนกนเปน triple helix -chain 3 ชนดของ -chain ใน collagen type ตางๆ Type I : 1(I)-chain 2 สาย และ 2(I)-chain 1 สาย Type II : 1(II)-chain 3 สาย (homotrimer) Type III : 1(III)-chain 3 สาย (homotrimer)

Biosynthesis of collagen 62 Nuclear event Transcription : ได primary transcript (hn. RNA) RNA processing : ไดแกการเกด 5’ capping, 3’ polyadenylation และ splicing ไดเปน m. RNA Translation เกดบน membrand-bound ribosome ได prepro -chain ทม signal sequence อยทางดาน N-terminus เพอใชในการเกด cotranslational translocation

Biosynthesis of collagen 63 Posttranslational modification Signal sequence จะถกตดออกจาก pro -chain prepro -chain กลายเปน Hydroxylation of prolyl and lysyl residues : เกดเปน hydroxy proline (สำคญตอ thermal stability) และ hydroxylysine (สำคญตอ tissue tensile strength) ขนตอนนใช vitamin C (ascorbate) เปน coenzyme O-linked glycosylation : เปนการเตม hydroxy lysine galactose หรอ glucose ใน N-linked glycosylation : เปนการเตม C-terminal ของ pro -chain mannose-rich CHO ท

Collagen synthesis 64 hydroxylation glycosylation

Collagen synthesis 65

Biosynthesis of collagen 66 Posttranslational modification Procollagen triple helix formation : เกดการรวมกนของ pro chain และพนกนเปนเกลยว ทศทางการเกดเรมจาก Cterminus ไป N-terminus เรยก triple helix molecule ทไดนวา procollagen Amino-terminal Carboxyl-terminal propeptide Telopeptide

Biosynthesis of collagen 67 Procollagen = triple helical domain + nonhelical part Nonhelical part = amino-terminal propeptide + telopeptide + carboxyl-terminal propeptide

Biosynthesis of collagen 68 Posttranslational modification Modification beyond RER : procollagen ถกสงไปยง และสงออกจากเซลลในรปของ secretory vesicle Golgi body Extracellular events amino-terminal propeptide และ carboxyl terminal propeptide จะถกตดออกโดย procollagen N-protease และ procollagen Cprotease ตามลำดบ เรยกโมเลกลทไดวา tropocollagen ซงมความสามารถในการละลายลดลง 100 เทา

Mutation of collagen genes 70 Dominant negative effect : การทม tropocollagen ทเกดจาก mutant collagen gene เขามารวมในโมเลกล collagen fibril ทำให collagen fibril นนเกดความผดปกตไปดวย Procollagen suicide : abnormal pro -chain (จาก mutant allele) รวมกบ normal pro -chain เกดเปน product

Diseases due to abnormal collagen 71 Osteogenesis imperfecta (brittle bone disease) Bone fragility Mutation ของ type I collagen สวนใหญมความผดปกตของ gene COL 1 A 1 หรอ COL 1 A 2 Type I : mutation ทขดขวางการ splicing และการสราง proprocollagen m. RNA ทำใหรางกายสงเคราะห collagen ปกตลดลง Type II, III และ IV : point mutation ของ glycine codon ซงจะยบยงการเกด normal helix

Diseases due to abnormal collagen 72 Osteogenesis imperfecta

73 Diseases due to abnormal collagen Ehler-Danlos syndrome Skin fragility, skin hyperextensibility และ joint hypermobility Type VI : ความผดปกตของการเกด hydroxylation ของ lysine Type VII : ความปกตในการตด amino-terminal propeptide ออก Type IX : ความผดปกตในการเกด cross-linked

Diseases due to abnormal collagen 74 Lathyrism Skin fragility, skeletal deformities และ severe blood vessel weakness สารพษจากเมลดของ sweet pea มฤทธยบยงเอนไซม (lysyl oxidase) ทควบคมการเกด cross-linked แบบ irreversible Scurvy Vitamin C deficiency Hydroxylation เกดไดไมด จงมปรมาณ hydroxylysine และ hydroxyproline ใน pro -chain ลดลง ทำให collagen stability และ tensile strength นอยลง

75 ANY QUESTIONS? THE END