Protein Extraction Homogenization Sonication FreezeThaw Reagent Detergent Figure

Protein Extraction • Homogenization : 조직, 식물의 세포벽 • Sonication : 조직 • Freeze/Thaw : 식물 • Reagent (Detergent) : 동물세포 (가장 많이 이용되는 방법)

Figure 11 -26 Essential Cell Biology (© Garland Science 2010)

Figure 11 -27 Essential Cell Biology (© Garland Science 2010)

Reagent(Detergent)를 이용한 lysis buffer Choice Detergent Anionic Non-Ionic Amphionic Effect membrane을 쉽게 분산시켜 버리긴 하지 만 모든 protein을 파괴하는 성질. (예 : SDS) 일정 농도에서 protein은 그냥 놔두고 lipid membrane만 파괴. (예 : Triton X-100, NP-40, Tween-20) 가용화 능력이 강하고 단백질 변성이 적음. p. H 7이하가 되면 용해도가 낮아짐. (예 : CHAPS)

Protease&Phosphatase Inhibitor Target Sodium Fluoride Sodium Orthovanadate benzamide Phenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF) 4 -(2 -aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride(AEBSF) Antipain Chymostatin Leupeptin Ser/Thr and Acidic Phosphatases Tyr and Alkaline Phosphatases Serine protease Cysteine protease Chemotrypsin Serine protease, Cysteine protease Peptatin A Asparagin산protease (산성protease) 금속protease Kallikrein, trypsin, chemotrypsin 금속protease Phosphoramidon Protinin Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)

Sample boiling (Denaturation) -정량이 끝난 후 SDSbuffer를 넣고 90℃에서 5분간 끓 인다. (Heat block 이용) - denaturation: 즉 3차 구조에서 1차 구조로 바꿔주기 위함. SDS를 negative charge을 띄게 하기 위함.

Transfer 방식

Blocking • 단 백 질 이 붙 지 않 는 filter의 여 백 에 5% skim milk* (or 5% BSA)의 단백질이 붙어서 antibody의 non-specific binding을 피 하 기 위함. • Ponceau S 용 액 을 D W나 PBS 로 washing (shaker에 서)

Chemiluminescent Detection

System Substrate 1 Chromogenic Detection method Product HRP DAB brown precipitate, addition of Ni or Co ions increases sensitivity TMB blue precipitate 4 CN blue/black precipitate AP BCIP/NBT black/purple precipitate Chemiluminescent (ECL, ECL Plus) HRP Luminol light, glow or flash AP Dioxetanephosphate light, glow Abbreviations: . . DAB: 3, 3'-diaminobenzidine. . 4 CN: 4 -chloro-1 -naphtol. . BCIP: 5 -bromo-4 -chloro-3 -indolyl phosphate. . NBT: nitroblue tetrazolium. . TMB: 3, 3'5, 5' tetramethylbenzidine 1