Protein concentration determination bergvogelyonsei ac kr S 338

Protein concentration determination 담당교수 : 이승택 교수님 조교 : 김준명 / 홍유리 bergvogel@yonsei. ac. kr S 338

Examples for Protein Conc. Determination 1) Western Blot 실험에서, 각 Cell lysate로부터 일정량의 단백질을 loading하는 경우 2) Protein Purification 후 얻어낸 Protein 총량을 계산하는 경우 3) enzyme과 substrate 반응 후, 단위 시간당 substrate의 농도 감소를 통하여, enzyme activity를 측정.

Property of Protein

Methods for Protein Conc. Determination Ø UV spectrophotometry Ø Biuret method Ø BCA method Ø Lowry method Ø Bradford method

UV spectrophotometry Principle - Phe, Tyr 그리고 Trp같은 Aromatic R groups는 280 nm의 자외선을 흡수하는 성질을 가짐. - 280 nm 에서의 Absorbance와 단백질의 농도가 비례하는 특성을 이용. Advantages - 측정 과정이 빠르고 Protein의 chemical modification이 없으므로 sample 회수 및 재사용 가능 Disadvantages - buffer, p. H, salt, nucleic acids 등에 영향을 받음. - Protein의 amino acids 조성에 영향을 받음.

BCA method Principle Protein과 Cu 2+ 이온을 반응시킨 후 (temperature-dependent) Bicinchoninate(BCA)가 Trp, Tyr, Cys의 도움으로 Cu+ 이온과 복합체를 형성하여 자색으로 발색하는 반응을 이용. 562 nm에서의 흡광도를 측정. Advantage 상대적으로 detergent에 의한 영향이 적음 Disadvantage DTT와 같은 reducing reagent에 의한 interference 존재

Lowry method Ø 구리이온이 peptide bond에 결합하는 Biuret method에 기초를 둠. Ø Cu 1+ 가 Folin reagent와 반응하는 원리를 이용함. 1 단계 : Biuret reaction : 알칼리 용액에서 Cu 2+와 protein peptide bond 간에 complex를 형성시켜서 Cu 2+가 Cu+로 환원된다. 2 단계 : Folin-Ciocalteu reaction : Cu+와 Trp, Tyr의 radical group이 Folin-Ciocalteu reagent (phosphomolybdate and phosphotungstate complex (노란색)를 환원시켜서 진한 청색으로 변한다. (yellow deep blue) blue 500 ~ 750 nm

Bradford method Ø Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBBG)가 Basic amino acid (Arg, Lys), Aromatic amino acid (Trp, Tyr, Phe)에 결합시의 흡광도의 변화를 측정 - CBBG가 free dye의 형태로 있을 때 최대 흡광 파장은 465 nm (red) red 이지만, amino acid 와 결합하여 anionic form일 때의 최대 흡광은 595 nm (blue) blue 인 특징을 이용. Free dye (Cationic) 465 nm Bound dye (Anionic) 595 nm

실험방법- Lowry ► Reagent A : 2% Na 2 CO 3 in 0. 1 N Na. OH Reagent B : 1 g Cu. SO 4. 5 H 2 O in 100 ml distilled water Reagent C : 2 g Potassium Tartrate in 100 ml distilled water ► 위의 reagent A: 9. 8 ml 에 B : 0. 1 ml , C : 0. 1 ml을 차례로 15 ml tube에 넣고 섞어준다. ► BSA로 standard 를 만든다. (Stock : BSA 1 mg/ml) BSA (ul) 0 5 7. 5 10 12. 5 15 Sample 10 20 DW (ul) 200 195 192. 5 190 187. 5 185 DW 190 180 total 200 ul ► 각 standard 와 sample 에 위에서 만든 solution 1 ml 씩 넣고 vortexing 한다. ► Room temp. 에서 15분간 incubation. ► Folin-phenol reagent를 D. W와 1: 1 dilution 하여 (500 ul : 500 ul) 하여 1 ml을 만든다. ► 각 standard 와 sample 에 Folin-phenol reagent를 100 ul를 넣고 바로 vortexing 한다. ► Room temp. 에서 30분간 incubation. ► Spectrophotometer로 600 nm에서 흡광도를 잰다.

실험방법 - Bradford ► BSA (1 mg/ml) 로 standard 만든다. BSA (ul) 0 2. 5 5 7. 5 10 15 sample 5 10 DW (ul) 200 197. 5 192. 5 190 185 DW 195 190 total 200 ul ► 각 tube에 Bradford solution를 800 ul 씩 넣은 후, 바로 vortexing 한다. ► 2분간 반응시킨 후, 595 nm에서 흡광도를 잰다.