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Prolonger votre offre de soins, jour après jour TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE : DE LA FISH AUX PUCES A ADN KARINE CORDIER-COUREL XXème colloque ATC Aix-en-Provence - 2010 Prolonger votre offre de soins, jour après jour
Prolonger votre offre de soins, jour après jour LA CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE Cytogénétique conventionnelle Cytogénétique moléculaire Biologie moléculaire
Prolonger votre offre de soins, jour après jour DE LA FISH AUX PUCES A ADN v v FISH (Hybridation In Situ en Fluorescence) • Principe • Différents types de sondes • Applications • Avantages et inconvénients CGH (Hybridation Génomique Comparative) • Principe • Sensibilité v FISH et CGH : Limites des techniques v Puces à ADN • Définitions • Différents types de puces • CGH-array • Puces à SNP • Intérêts, applications, inconvénients
Prolonger votre offre de soins, jour après jour FISH : Principe FISH = Fluorescence In Situ Hybridization v Hybridation de séquences spécifiques marquées sur un génome entier : centromères, régions sub-télomériques, loci spécifiques et peintures v Détection de délétions, identification de translocations ou d’autres réarrangements chromosomiques
Prolonger votre offre de soins, jour après jour FISH : Principe SONDE CIBLE ADN double brin (mitoses ou noyaux interphasiques) ADN double brin marqué Dénaturation thermique T A A G G A T A A T T C C T A T Hybridation complémentaire 37°C O/N
Prolonger votre offre de soins, jour après jour FISH : Principe Elimination des sondes non spécifiquement fixées Lavages La sonde moléculaire se fixe sur sa cible Pas de sonde fixée = délétion Analyse au microscope en épifluorescence (filtres adaptés aux différents fluorochromes)
Prolonger votre offre de soins, jour après jour FISH : Différents types de sondes Peintures chromosomiques Sondes centromériques M-FISH
Prolonger votre offre de soins, jour après jour FISH : Différents types de sondes Loci spécifiques (Tuple 1 / N 85 A 3) Sondes télomériques RP 11 -335 E 8 2 p 12 Sondes de BACs RP 11 -356 H 17 2 p 13. 3
Prolonger votre offre de soins, jour après jour FISH : Sondes de BAC v Bacterial Artificial Chromosome = ADN circulaire bactérien dans lequel un fragment d’ADN (du génome humain) a été inséré v Sonde de BAC = sonde fabriquée à partir d’une séquence d’ ADN connue insérée dans un vecteur de clonage bactérien
Prolonger votre offre de soins, jour après jour FISH : Choix des BACs v Sélection des BACs selon leur localisation chromosomique (en fonction du réarrangement à étudier) ou la séquence d’un gène d’intérêt v Séquençage du génome humain => Cartographie des chromosomes => bases de données
Prolonger votre offre de soins, jour après jour FISH : Choix des BACs National Center for Biotechnology Information http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/mapview/map_search. cgi? ta xid=9606 University of California Santa Cruz http: //genome. cse. ucsc. edu/cgi-bin/hg. Gateway Ensembl Genome Browser http: //www. ensembl. org/Homo_sapiens/index. html
Prolonger votre offre de soins, jour après jour FISH : Choix des BACs NCBI
Prolonger votre offre de soins, jour après jour FISH : Choix des BACs NCBI
Prolonger votre offre de soins, jour après jour FISH : Fabrication de sondes de BAC Extraction de l’ADN bactérien Culture bactérienne Technique « lourde » 6 à 8 jours BAC Extraction et fragmentation de l’ADN bactérien Marquage par nick -translation (DNase. I, ADN pol, d. NTP, d. UTP*) cot 1, Ac. Na, Et. OH Technique rapide 3 à 5 jours Marquage par nick -translation (DNase. I, ADN pol, d. NTP, d. UTP*) Amplification par PCR (d. NTP, amorces, ADN pol) Sonde prête à l’emploi pour la FISH
Prolonger votre offre de soins, jour après jour FISH : Applications v Confirmation d’anomalies suspectées par le caryotype v Précision de points de cassure v Origine des marqueurs, dm, hsr v Détection des aneuploïdies v Détermination du sexe v Microdélétions v Suivi de traitements, recherche de maladie résiduelle v Suivi d’allogreffe (avec sexe opposé) de moelle
Prolonger votre offre de soins, jour après jour FISH : Avantages et Inconvénients Avantages v Technique sensible (noyaux et Inconvénients v Technique lourde nécessitant des traitements différents selon la nature de l’échantillon à analyser (métaphases, noyaux, tissus) v Analyse ciblée : Nécessité d’avoir une idée préalable de la région chromosomique ou du gène à étudier v 3 cibles maximum par test métaphases) v Grand choix de sondes (commerciales ou « maison » )
Prolonger votre offre de soins, jour après jour CGH : Principe ADN de référence ADN à tester Co-hybridation nb copies ADN de référence > nb copies ADN test => délétion nb copies ADN test > nb copies ADN de référence => amplification
Prolonger votre offre de soins, jour après jour FISH et CGH : Limites des techniques Caryotype CGH FISH Analyse globale du génome Etude ciblée Résolution = 5 -10 Mb Résolution = 100 -300 Kb Comment réaliser une analyse globale du génome et augmenter la résolution? Þ Hybrider de nombreuses sondes sur un échantillon? Þ Hybrider un échantillon sur de nombreuses sondes?
Prolonger votre offre de soins, jour après jour PUCES A ADN : Définitions v Petites surfaces solides sur lesquelles un grand nombre de sondes ont été fixées v Puces à ADN = DNA arrays, DNA chips, DNA micro-arrays ou microarrays v BAC-array = sondes de BACs v DNA-array = faible densité (quelques centaines à quelques milliers de sondes) v DNA micro-array = haute densité (plusieurs milliers de sondes) v puces « pangénomiques » = ensemble du génome v puces « à façon » = ciblant une fonction biologique ou une pathologie
Prolonger votre offre de soins, jour après jour PUCES A ADN : Différents types de puces Il existe trois types de technologies : v CGH-array proprement dite ( hybridation génomique comparative par rapport à un ADN de référence) Ø Bac-array (Array 300 Abbott, Cyto Chip Blue Gnome, …) : résolution limitée (50 -200 Kb) Ø Puces à oligo (Agilent) : meilleure résolution (oligonucléotides de 60 -mer) v Puces à SNP ne nécessitant pas d’ADN de référence ( Illumina, Affymetrix) : haute résolution (oligonucléotides de 25 à 80 -mer) + recherche de régions de perte d’hétérozygotie
Prolonger votre offre de soins, jour après jour PUCES A ADN : Etapes techniques v Extraction de l’ADN => quantification (A 260 nm) => pureté (A 260 nm / A 280 nm) => intégrité (migration sur gel d’agarose) v Digestion par des enzymes de restriction / Amplification par PCR v Marquage et Fragmentation v Hybridation v Lavages v Quantification du signal d’hybridation pour chaque sonde (lecture par un scanner) v Numérisation par un logiciel spécifique
Prolonger votre offre de soins, jour après jour CGH-array : Principe v Principe biochimique d’hybridation complémentaire ADN/ADN (ou ARN/ARN) v Co-Hybridation compétitive de séquences d’ADN (ou ARN) test et témoin marqués par fluorescence sur un grand nombre de loci spécifiques présents sur un support solide (lame de verre) v Identification de pertes ou de gains d’ADN au niveau de loci spécifiques et connus sur un génome entier
Prolonger votre offre de soins, jour après jour CGH-array : Principe Loci spécifiques (BAC / PAC / oligonucléotides de synthèse) ADN test marqué en CYA 3 Dénaturation et hybridation sur puce à ADN Lame de verre SCANNER ADN de référence marqué en CYA 5 Défaut d’ADN test Excès d’ADN test
Prolonger votre offre de soins, jour après jour CGH-array : Capture et Analyse des résultats Ex : BAC-array / Array-300 Abbott® DAPI IV (sondes) Cy 3 (ADN Test) Cy 5 (ADN Référence) 3 spots / clone • 0. 8 < T/R < 1. 2 => pas de déséquilibre • T/R < 0, 8 => délétion ratio T/R calculé • T/R > 1, 2 => amplification
Prolonger votre offre de soins, jour après jour CGH-array: Exemple d’application v Dysmorphie faciale => caryotype t(5; 9) + dup(9)(q? )
Prolonger votre offre de soins, jour après jour CGH-array: Exemple d’application v Confirmation par FISH (peintures des chromosomes 5 et 9) Peinture du chromosome 9 Peinture du chromosome 5
Prolonger votre offre de soins, jour après jour CGH-array: Exemple d’application v Résultats analyse sur puce Array-300 Abbott®
Prolonger votre offre de soins, jour après jour CGH-array: Exemple d’application v Résultats analyse sur puce Integra. Gen®
Prolonger votre offre de soins, jour après jour Puces à SNP: Principe v Les oligonucléotides spécifiques sont synthétisés directement sur la puce v Principe biochimique d’hybridation complémentaire ADN/ADN (ou ARN/ARN) v L’ADN à tester s’hybride avec sa séquence complémentaire fixée sur la puce v Identification de pertes ou de gains d’ADN au niveau des marqueurs spécifiques et connus sur un génome entier v Identification de pertes d’hétérozygotie (LOH)
Prolonger votre offre de soins, jour après jour Puces à SNP: Analyse des résultats Puce SNP 6. 0 / Affymetrix ®
Prolonger votre offre de soins, jour après jour Puces à SNP: Analyse des résultats
Prolonger votre offre de soins, jour après jour Puces à SNP: Analyse des résultats
Prolonger votre offre de soins, jour après jour Puces à SNP: Analyse des résultats Puce SNP 6. 0 / Genotyping Console / Affymetrix ®
Prolonger votre offre de soins, jour après jour Puces à SNP: Analyse des résultats Allèle Différence Log 2 Ratio Copy Number state Segments Fishclones (BACs) Genomic variants (polymorphismes) Refseq (gènes) Idéogramme / règle
Prolonger votre offre de soins, jour après jour Puces à SNP: Analyse des résultats FISH CLONES (BAC)
Prolonger votre offre de soins, jour après jour Puces à SNP: Analyse des résultats Refseq (gènes)
Prolonger votre offre de soins, jour après jour Puces à SNP: Analyse des résultats Genomic Variants
Prolonger votre offre de soins, jour après jour Puces à SNP: Analyse des résultats
Prolonger votre offre de soins, jour après jour Puces à SNP : Résolution SNP 6. 0 (Affymetrix) Cytogenetics Array (Affymetrix) Copy Number Marker 1 878 785 2 761 979 SNP 945 806 400 103 Ref. Seq genes 12 093 (64, 7%) 18 270 (97, 7%) Cancer genes 233 (73, 3%) 318 (100%) OMIM genes 8 068 (43, 1%) 12 046 (97, 6%) Average marker spacing (bp) 1, 629 1, 086
Prolonger votre offre de soins, jour après jour Puces à ADN : Intérêts v Pas de mise en culture des cellules à analyser v Analyse l’ADN de tout type de tissus v Technique hautement résolutive (< 150 Kb) v Analyse pangénomique qui ne nécessite pas d’avoir une idée préalable de chromosomes impliqués (# FISH)
Prolonger votre offre de soins, jour après jour Puces à ADN : Applications v Corrélations nombre de copies / conséquences biologiques v Compréhension de maladies (Couplée à une puce à ARN ) v Comparaison tumeur/tissu sain v Etude du génome des patients atteints d’une même pathologie et compréhension des mécanismes géniques
Prolonger votre offre de soins, jour après jour Puces à ADN : Inconvénients v Anomalies chromosomiques équilibrées non détectables v Polymorphismes (encore beaucoup d’interrogations à ce sujet) v Seuil de sensibilité, mosaïques faibles? v Plateau technique onéreux
Prolonger votre offre de soins, jour après jour CONCLUSION C I B L E S S U P P O R T CARYOTYPE 5 -10 Mb FISH 5 Mb à 100 -300 Kb Recherche d’ Génome entier Métaphases Anomalies chromosomiques Métaphases Micro-remaniements Régions spécifiques Noyaux interphasiques (sub-télomèriques, centromériques, loci, …) Coupes de tissus Points de cassures Marqueurs Aneuploïdie Sexe Suivi de maladie Chromosomes entiers Loci spécifiques CGH-ARRAY / PUCES (BACs ou oligonucléotides ADN de synthèse) 10 -300 Kb I N T E R E T S Génome entier ADN ou ARN Analyse de tout type d’échantillon (sang, moelle, tissu sain, tumeur) Détection de déséquilibres cryptiques non détectable cryptiques par les autres techniques L I M I T E S Technique longue Peu sensible pour les anomalies Peu sensible cryptiques (mais technique de référence en cytogénétique) TK lourde et peu automatisable 3 cibles / test Recherche ciblée Ne détecte pas les anomalies chromosomiques équilibrées Polymorphismes Mosaïques faibles
Prolonger votre offre de soins, jour après jour Remerciements v Département Génétique du Laboratoire v Equipe de R&D: Azarnouche Ardalan, Anne Bazin, Catherine Destigny, Hossein Mossafa v Françoise Allamy et son équipe de FISH v Sophie Pedronno et son équipe de Biologie moléculaire
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