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Prolonger votre offre de soins, jour après jour Séparation magnétique des plasmocytes dans le cadre des myélomes multiples Prolonger votre offre de soins, jour après jour Elodie DAVID Equipe Onco-hématologie en cytogénétique

Prolonger votre offre de soins, jour après jour Sommaire 1. Le Myélome Multiple : Définition 2. La purification des plasmocytes : Pourquoi ? 3. La séparation magnétique : Principe 4. Les outils de séparation : Différents appareils

Prolonger votre offre de soins, jour après jour 1. Le Myélome Multiple v Définition : prolifération maligne d’un clone plasmocytaire produisant de manière inadaptée et exagérée une immunoglobuline ou l’un de ses fragments 3 stades (classification de Durie et Salmon) : Stade III Plasmocytes matures Plasmocytes immatures Cytoplasme important Plasmoblastes Formation d’agrégats

Prolonger votre offre de soins, jour après jour 1. Le Myélome Multiple v Incidence: -Augmente avec l’âge -Légèrement plus fréquent chez l’homme que chez la femme -Moyenne d’âge de 64 ans v Signes cliniques: -Lésions osseuses -Hypercalcémie -Anémie -Insuffisance rénale… v Diagnostic : -Mise en évidence d’une gammapathie monoclonale sérique et/ou urinaire -Mise en évidence d’une prolifération plasmocytaire médullaire

Prolonger votre offre de soins, jour après jour 1. Le Myélome Multiple v Anomalies cytogénétiques : - Hyperdiploïdie : 48 -74 chromosomes : +3, +9, +15, +19… sans anomalies de - Hypodiploïdie structure associées - t(4; 14) - Délétion totale ou partielle des chromosomes 13 et 17 Valeur pronostique permettant un traitement adapté v Diagnostic et suivi : Cytogénétique conventionnelle : vue d’ensemble du caryotype hyperdiploïdie ET Cytogénétique moléculaire : plus précis et sensible anomalies fines comme t(4; 14), del(13), del(17)

Prolonger votre offre de soins, jour après jour 2. Pourquoi une purification des plasmocytes? Etude du Myélome Multiple = étude des plasmocytes Plasmocytes dilués dans la masse cellulaire Tri magnétique des plasmocytes avec étude des chromosomes 4, 13 et 17

Prolonger votre offre de soins, jour après jour 3. Séparation magnétique des plasmocytes Plasmocytes = CD 138+ Principe : 1. Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD 138 couplé à une bille magnétique 2. Tri sur colonne magnétique 3. Création d’un champ magnétique 4. Récupération des plasmocytes en cassant le champ magnétique 3 appareils (Miltenyi) : - Vario. MACS - Auto. MACS Pro

Prolonger votre offre de soins, jour après jour 3. Séparation magnétique des plasmocytes v Vario. MACS et Auto. MACS Plasma 1 Filtration de la moelle totale 2 Réalisation d’un ficoll Récupération des globules blancs au niveau de l’anneau Cellules mononuclées Ficoll Polynucléaires et globules rouges 3 Lavage 4 Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD 138 couplé à une bille magnétique 5 Lavage 6 7 Passage de l’échantillon dans une colonne de billes magnétiques Création d’un champ magnétique Récupération de la fraction négative Cassure du champ magnétique Récupération fraction positive

Prolonger votre offre de soins, jour après jour 3. Séparation magnétique des plasmocytes v Vario. MACS et Auto. MACS Perte cellulaire dans le ficoll : - cellules de tailles différentes II I III - agrégations protéique et plasmocytaire Colonnes et valves souvent saturées Technique lourde (temps) Utilisation de l’Auto. MACS Pro

Prolonger votre offre de soins, jour après jour 3. Séparation magnétique des plasmocytes v Auto. MACS Pro 1 2 3 4 Filtration de la moelle totale Lavage Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD 138 couplé à une bille magnétique Lavage 5 Tri magnétique sur Auto. Macs Pro 3 tubes : échantillon, fraction négative et positive 6 Sélection du programme 7 Après cassure du champ magnétique, récupération fraction positive 8 Après technique, 3 lames étalées : t(4; 14), 13 et 17

Prolonger votre offre de soins, jour après jour 3. Séparation magnétique des plasmocytes v. Auto. MACS Pro Travail sur moelle totale : Ac anti-CD 138 plus concentrés rendement augmenté (>86% : panel FISH complet) Adaptation du programme de séparation pureté augmentée (<5% d’échec de purification) Tampons plus agressifs et filtres 40 µm automate moins saturé, maintenance adaptée Automatisation Gain de temps

Prolonger votre offre de soins, jour après jour CONCLUSION Séparation magnétique : v routine dans les bilans de myélome multiple v si nécessaire préférée à la mise en culture v support pour les études pangénomiques

Prolonger votre offre de soins, jour après jour Remerciements L’équipe d’onco-hématologie en cytogénétique, CERBA L’équipe de FISH, CERBA Hossain MOSSAFA, cytogénéticien à CERBA MILTENYI

Prolonger votre offre de soins, jour après jour Annexe 1 : Classification de Durie et Salmon http: //med 2. pagespersoorange. fr/import/CANCERO/ CLASSIFICATION/MYELOM E. htm

Prolonger votre offre de soins, jour après jour Annexe 2 : quelques anomalies cytogénétiques del(13)(q 14 q 21) Bandes G 4 p 13 : fluorochrome rouge 14 q 32 : fluorochrome vert t(4; 14)(p 13; q 32) del(17)(p 11) Bandes R

Prolonger votre offre de soins, jour après jour Annexe 3 : mise en place d’un nouveau protocole Bone Patient Marrow (ml) 07 D 0570 753 4. 8 m. L 07 D 0572 733 6. 2 m. L 07 D 0566 314 4. 3 m. L 07 D 0577 164 5. 8 m. L 07 D 0583 892 3 m. L 07 D 0583 530 5. 3 m. L 07 D 0587 071 2. 7 m. L 07 D 0606 916 6. 1 m. L 07 D 0609 147 6. 8 m. L 07 D 0609 191 6. 3 m. L Total WBC % Theoric Plasma Total cells plasma slide cells 3. 3*10^ 36% 60% 6. 5*10^6 6 c/m. L 8% 5. 8*10^ 6 c/m. L 72. 7% 2. 6*10^7 5% 4. 1*10^ 6 c/m. L 59. 3% 1*10^7 4% 5. 6*10^ 6 c/m. L 1% 3. 2*10^5 4*10^6 22% c/m. L 15% 1. 8*10^6 0% 8. 4*10^ 6 c/m. L 5% 2. 2*10^6 3*10^6 15% c/m. L 12% 9. 7*10^5 3% 7. 7*10^ 6 c/m. L 1% 4. 7*10^5 1. 1*10^ 60% 6 c/m. L 5% 3. 7*10^5 8% 1. 6*10^ 7 c/m. L 1% 10^6 Micro. Be ads 50 µL Control Obtened Purity Total Perform by flow Labeled P ance cytometry cell 94, 60% 5. 3*10^5 50 µL 93, 4 5. 6*10^5 50 µL 68, 40% 10. 9*10^ 4 50 µL 72, 80% 1. 7*10^5 50 µL 88, 40% 2. 5*10^5 50 µL 65, 50% 5. 2*10^4 50 µL 88, 70% 1. 8*10^5 50 µL 31% 7. 4*10^4 50 µL 54, 10% 1. 5*10^5 50 µL 65, 50% 1. 8*10^5 % of plasma cells reported by cytologist % and total plasma cells number determined by flow cytometry labelled by CD 138/CD 38 8, 15% 2, 15% 1, 10% 53, 13% 13, 90% 2, 36% 19% 15, 70% 40, 50% 18, 00% 1 er test 2007 : Programme Possel-D avec utilisation uniforme de 50µL d’Ac anti-CD 138 Mauvais rendement : adaptation de la quantité d’Ac : 50µL Ac pour 107 cellules

Prolonger votre offre de soins, jour après jour Annexe 4 : Comparaison des programmes de séparation Possel-D+Rinse # Possel WB+Clean Possel. WB+Clean = Meilleur rendement Pas assez de noyaux pour réaliser une FISH