Programma Applicazione della genetica microbica e biotecnologie tecnica

Programma • Applicazione della genetica microbica e biotecnologie (tecnica del DNA-ricombinante, vettori di clonaggio e mutagenesi) • L’era genomica ed i genomi microbici: Genetica e genomica batterica indirizzata allo studio dei nuovi target molecolari (PCR e progettazione di primers, Real-Time PCR, DNA sequencing; analisi di sequenza, comparazione di sequenza nucleotidiche e aminoacidiche (BLAST, Clustalw, Ex. PASy) • • Diagnostica immunologica, anticorpi monoclonali, Sistemi diagnostici a DNA • • Probiotici e loro applicazioni, microbiomi Bersagli e saggi per scoprire nuovi agenti antibatterici: morte cellulare programmata quale bersaglio per antibiotici, s. RNA, sistemi TA Testi consigliati: • • • Biologia dei microrganismi, Gianni Deho, Enrica Galli Molecular Genetics of Bacteria- Jeremy Dale Editor John Wiley and Sons Molecular Genetics of Bacteria-Snyder&Chapman ASM Pre Microbial Biotechnology – Lee Yuan Kun Glick et al – Molecular Biotechnology 3 th ed. ASM

Ruolo dei microrganismi in natura e loro utilizzazione da parte dell’uomo Alcune proprietà dei batteri hanno facilitano gli esperimenti di genetica: § i batteri sono aploidi § tempo di generazione breve §riproduzione asessuata (formazione di cloni) §crescita su terreno solido (individuazione di ceppi mutati) §coltura pura §selezione : mutanti (condizioni selettive di crescite) §mantenimento delle colture batteriche §scambi genetici: trasformazione, coniugazione, trasduzione

Microbial diversity Ø prokaryotic cells on Earth = 6 X 1030 ØAbundant in environments where eukaryotes are rare Ø How many species? -Lack diagnostic morphological characteristics -Exchange genetic material in unique and unusual ways -Same species = 70% DNA-DNA hybridization -Under estimating prokaryotic diversity -Practical limitations in counting - 1% cultivable

L’Era Genomica Il 1995, data della pubblicazione del prima genoma procariotico (Haemophilus influenzae) segna l’inizio dell’era genomica. 4 Da: Binnewies et et al. (Funct. Integr. Genomics 6: 165 -185, 2006)

outline Bacterial genome size q. Core q. Horizontal Gene Transfer (HGT) q. Mechanisms of HGT q. Detecting HGT q. Comparative genomics q. Universal Tree of Life q. Applications of microbial genomics:

La Genomica Strutturale. Studio della struttura del genoma, identificazione di geni, di elementi regolatori ed altre entità informazionali. Genomica Funzionale. Studio delle funzioni dei geni, delle loro interazioni (pathways metabolici) e dei meccanismi che ne regolano l’espressione. 7

La Genomica Comparata Stele di Rosetta (British Museum) Gli studi di Genomica Strutturale e Funzionale traggono grande vantaggio dall’analisi comparativa dei genomi e dei loro prodotti di espressione. Il confronto di entità “omologhe” ci aiuta ad interpretare l’informazione genica. 8

• 1995: Haemophilus influenzea - primo genoma batterico sequenziato completamente - 1. 830. 000 paia di basi • 1996: Saccharomyces cerevisiae - primo genoma eucariotico sequenziato - 13. 000 paia di basi • 2000: Drosophila melanogaster - 130. 000 paia di basi • Homo sapiens - in corso - 3. 000 paia di basi

Microbial Genomes Organism Size (Mb) G+C Status Funding Bacteroides fragilis NCTC 9343 5. 20 43. 1% Finished Beowulf Genomics Bacteroides fragilis 638 R ~5. 2 43% Finishing/ gap closure Beowulf Genomics Bordetella avium 3. 73 61. 6% Finished USDA Bordetella bronchiseptica 5. 34 68. 1% Parkhill et al. Nature Genetics 35 32 -40 (2003) Beowulf Genomics Bordetella parapertussis 4. 77 68. 1% Parkhill et al. Nature Genetics 35 32 -40 (2003) Beowulf Genomics Bordetella pertussis 4. 09 67. 7% Parkhill et al. Nature Genetics 35 32 -40 (2003) Beowulf Genomics 3. 87 + 3. 22 + 0. 88 66. 9% Finished Beowulf Genomics Bacteriovorax marinus Burkholderia cenocepacia 3. 44 36. 7% Finished Wellcome Trust (formerly Burkholderia cepacia) TIGR ( The Institute for Genomic Research ( http: //www. tigr. org)

La scelta dei microrganismi da sequenziare è proporzionale al loro interesse nel settore scientifico e sociale -Biomedico: sequenziamento di microrganismi patogeni responsabili di gravi malattie o malattie particolarmente diffuse -Biotecnologico: identificazione di nuovi enzimi da utilizzare in biotecnologia (es: gli enzimi di microrganismi sono più stabili a temperature elevate)

Analisi e gestione del genoma dei procarioti La genomica: studio della struttura, dell’informazione contenuta in essa (espressione genica e genomica funzionale) e dell’evoluzione dei genomi. Obiettivo principale dell’analisi dei genomi è: conoscere e capire la biologia di ciascun organismo in termini di funzionalità ed evoluzione. Bioinformatica denominata anche “Biologia computazionale”: settore interdisciplinare che utilizza un approccio informatico per risolvere problematiche di tipo biologico. Gioca un ruolo determinante nelle applicazioni di genomica funzionale, genomica strutturale e proteomica. Ha un ruolo fondamentale anche nello sviluppo di nuovi farmaci (drug discovery). -Analisi del “complex interplay” di differenti geni contemporaneamente - necessità di tecnologie nuove Scienze “omiche”…genomica, trascrittomica, Proteomica, metabolomica, fenomica…………

La conoscenza di un genoma e la regolazione dei singoli geni: -ricerca di “genetic weakness” da utilizzare come potenziali target per la scoperta di nuovi antibiotici -conoscenze e regolazione di geni coinvolti nelle vie metaboliche per la coltivazione di “ microrganismi esigenti” -comparazione genica (comparativa genomics) tra microrganismi patogeni e non patogeni per l’individuazione di geni coinvolti nella patogenicità

Metagenomics is an emerging tecnology that enable the study of bacteria using genetic information from DNA that is extracted directly from natural environments

Tecnologie innovative per il sequenziamento Criteri di qualità del sequenziamento: • completezza: assenza di regioni non sequenziate • Accuratezza: misura della coerenza interna della sequenza : % di errore • struttura: assemblaggio delle sequenze ottenute (subcloni, conting) G. Dehò, E. Galli Biologia dei Microrganismi Copyright 2012 C. E. A. Casa Editrice Ambrosiana

History of DNA sequencing…… Based on chain –termination method

Chromosome walking

Selection of primers for Polymerase Chain Reaction Un fattore fondamentale per la “qualità” delle PCR è la scelta del primers • specificità • valutare Tm (Melting temperature ) • stabilità del primer (formazione di dimeri e loops)

Chromosome walking mediante PCR e sequenziamento diretto - Inverse-PCR - Anchored-PCR

Chromosome walking by Inverse-PCR primer

PCR inversa (IPCR) Eco. RI Xho Eco. RI Bam HI primer 1 primer 2 1. Digestione del DNA Con enzimi di restrizione primer 1 primer 2 2. Ligazione e circolarizzazione Bam HI 3. PCR con i primer orientati verso l’esterno Xho Eco. RI primer 2 primer 1

Inverse PCR & DNA sequencing Rapid identification of transposon-inserted flanking sequence by inverse PCR method

Anchored-PCR Genomic DNA Restricted and ligated to the generic oligomer linker Vector/generic oligo unknown fragment /known fragment Unknown fragment/ known fragment Vector/generic oligo amplification amplified specific fragment

Sequenziamento NGS: Next Generation Sequencing