PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI Produzione proteine umane in

PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI Produzione proteine umane in grandi quantità sostituisce la purificazione da: - organi o tessuti animali di proteine animali a volte poco efficaci o con effetti allergici o contaminanti; - organi e tessuti umani (sangue o organi di cadaveri); es. purificazione ormoni della crescita da ipofisi e rischio di malattia Creutzfeld-Jacob - Produzione in batteri - Produzioni in eucarioti microbici - Produzioni in cellule animali vantaggi: modificazioni post-traduzionali delle proteine autentiche svantaggi: colture costose (supporto solido per la crescita, densità minime, uso di vettori virali e possibili conseguenze nella co-purificazione) - Produzioni in animali e piante transgenici = pharming (pharmacological e farming) vantaggi: modificazioni post-traduzionali delle proteine autentiche

PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE, EUCARIOTICHE O PHARMING PRODOTTO MALATTIA Insulina Diabete Somatostatina Disordini della crescita, acromegalia, nanismo Somatotrofina Disordini della crescita, acromegalia, nanismo Fattore VIII Emofilia A Interferone (vari) Leucemia e altri tumori Fattore di crescita epidermide Ulcere Fattore di crescita fibroblasti Ulcere Eritropoietina Anemia Attivatore tissutale plasminogeno Infarto

PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE: INSULINA Molecola piccola non glicosilata, ponti disolfuro Proteina di fusione: vettore p. BR 322; pochi aa della -galattosidasi di E. coli seguiti dalla metionina Formazione del legame disolfuro inefficiente! Cambiata la sintesi (vedi diapo successiva)

PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE: INSULINA Dopo ripiegamento spontaneo tagli proteolitici eliminano il peptide leader “L” (trasporto nel RE) e il segmento C

PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE: SOMATOSTATINA Molto piccola: solo 14 aa = 42 bp aa della -galattosidasi di E. coli seguiti dalla metionina

PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE: SOMATOTROFINA Proteina grande: 191 aa Estrazione di m. RNA ipofisario, produzione c. DNA, Sito di taglio per Hae. III inserimento leader sintetico, clonaggio, trasformazione batteri, produzione proteina Leader sintetico: codoni 1 -24 sostituiti (stessi aa) per corretta traduzione (propensione del codice) in E. coli

PRODUZIONE DI PROTEINE IN CELLULE ANIMALI - Cellule di insetto in coltura (sistema di espressione: baculovirus) - Insetti vivi (sistema di espressione: virus patogeni specifici) - Cellule di mammifero in coltura - Animali vivi come bioreattori (pharming)

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO IN CELLULE DI MAMMIFERO 1) Trasferimento genico diretto: - trasfezione di DNA mediata da liposomi - trasfezione di DNA mediata da recettori - trasfezione di DNA libero - trasfezione di DNA tramite microiniezione nel nucleo 2) Trasferimento tramite vettori - plasmidici - virali (trasduzione) 3) Tipi di Inserzione: - ectopica - mirata 4) Obiettivi: - Produzione di proteine e farmaci - Inserzione di geni in cellule specifiche per creazione di animali transgenici - Terapia genica somatica nell’uomo

Trasferimento genico diretto Trasfezione (per endocitosi) mediata da liposomi anionici o cationici Analogo sintetico del doppio strato fosfolipidico di membrana DNA trasportato nell’interno DNA trasportato all’esterno

Trasferimento genico diretto Trasfezione (per endocitosi) mediata da recettori Esempio: utilizzo recettore Tf. R

Trasferimento genico diretto

Trasferimento genico diretto Trasfezione DNA libero con microiniezione Inserzione di più copie di DNA lineare

Trasferimento genico tramite vettori virali Virus a DNA o ad RNA Obiettivo Introdurre e pilotare l’espressione di transgeni in cellule in coltura Espressione -Transitoria per transgeni non integrati nel genoma ospite, elevata espressione ma necessario trattamento ripetuto - Stabile ma ridotta per transgeni integrati Svantaggi - Possibile mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) - Inserzione di geni (o molecole di DNA) di dimensioni limitate - Tecniche con bassa efficienza e costi elevati

Trasferimento genico tramite vettori virali Sistema vettoriale Ospite e localizzazione Considerazioni SV 40 Vari mammiferi può o meno integrarsi Adenovirus (virus raffreddore) Vari mammiferi, di solito episomico Inserto fino a 8 kb, elevato livello espressione Virus adeno-associati Vari mammiferi, si integra siti specifici cromosoma 19 Inserto fino a 4, 5 kb, necessita di adenovirus per packaging Papillomavirus (cancro del collo uterino) Vari mammiferi, integrazione stabile Inserzione DNA di buone dimensioni Elevato livello espressione Retrovirus Ampia gamma, si integra come c. DNA Dimensioni fino a 8, 5 kb

Trasferimento genico tramite vettori virali Svantaggi • • Virus non integrati: espressione transiente Virus integrati: espressione stabile, possibile mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) Inserzione di geni (o molecole di DNA) di dimensioni limitate Tecniche con bassa efficienza e costi elevati

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO IN CELLULE DI MAMMIFERO Inserzione ectopica: effetto di posizione Influenza di elementi di regolazione endogeni (enhancer, silenziatori) Influenza struttura cromatina (eterocromatina, DNA ipermetilato) Inserzione mirata Inserimento nel genoma in una posizione occupata da sequenza omologa Controllo di espressione del transgene Uso di promotori costitutivi (es: promotore + enhancer di SV 40) per geni sempre attivi e molto espressi Uso di promotori inducibili specifici per tipo cellulare o stadio di sviluppo Uso di proteine di fusione che facilitano rilevazione cellulare (o purificazione)

INGEGNERIA GENETICA NEGLI ANIMALI Transgenesi: tecnologia del trasferimento genico per introdurre sequenze di DNA nel genoma di cellule animali (o vegetali) - Creazione di linee cellulari transgeniche - Creazione di animali transgenici (contengono il gene clonato in tutte le loro cellule) Scopi: - Produzione di proteine ricombinanti a scopo farmacologico (anche da animali vivi: pharming) - Creazione di modelli animali per malattie umane - Ingegnerizzazione di cellule umane per la terapia genica in vivo o ex vivo

Trasferimento genico tramite vettori virali in cellule di mammifero Siti di clonaggio Primo virus utilizzato fine anni ‘ 70: Virus della scimmia (SV 40) Genoma 5, 2 kb Promotore costitutivo forte Eliminazione di alcuni geni virali per inserire DNA esogeno Adatto a molti tipi cellulari Alta efficienza espressione transiente Limitazioni inserto permettere packaging

PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI IN CELLULE DI MAMMIFERO: IL FATTORE VIII Produzione in E. coli impossibile 26 esoni e 25 introni 2351 aa Proteina dimerica: subunità A e C con 17 legami disolfuro e molti siti glicosilati Necessari 17 legami disolfuro e glicosilazione: tentativi di produzione in E. coli ma proteina non attiva!

PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI IN CELLULE DI MAMMIFERO: IL FATTORE VIII Due c. DNA (subunità A e subunità C) clonati in 2 vettori di espressione plasmidici separati. Promotore Ag: ibrido sequenza promotori -actina di pollo e -globina di coniglio Plasmidi introdotti in linea cellulare di hamster Produzione efficiente e proteina attiva FVIII prodotto anche tramite pharming, promotori tissutali specifici (es: - lattoglobulina per secrezione proteina nel latte del maiale)

PROTEINE PRODOTTE IN FLUIDI BIOLOGICI DI ANIMALI TRANSGENICI USATI COME BIOREATTORI Sistema Specie Prodotto Latte Maiale Fattore VIII Topo Attivatore plasminogeno tissutale umano Ormone della crescita umana Fibrinogeno umano Coniglio Eritropoietina umana Pecora 1 -antitripisina umana Fattore IX Capra Attivatore plasminogeno tissutale umano Siero (sangue) Coniglio 1 -antitripisina umana Urine Topo Ormone della crescita umana

CREAZIONE DI ANIMALI TRANSGENICI 1) Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile di una cellula uovo appena fecondata. Se l’inserimento genico riesce, tutto l’animale che ne deriva è trangenico (comprese cellule germinali) 2) Trasferimento nucleare di cellula somatica con transgene in oocita fecondato privo di nucleo e reimpianto in madre surrogata. Tutto l’animale che ne deriva è trangenico 3)Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti di madre surrogata L’animale che ne deriva è chimerico (produrrà transgenici solo se le sue cellule germinali contengono il transgene) A monte del gene da esprimere sempre inserito un promotore, a volte con specificità tissutali

CLONAGGIO NELLE CELLULE DI MAMMIFERO CON MICROINIEZIONE NEL PRONUCLEO MASCHILE Trasferimento genico mediante microiniezione nel pronucleo maschile - Microiniezione di plasmidi batterici con DNA gene da inserire - Microiniezione di copie di DNA lineare (privo di vettore) Inserimento nel DNA cromosomico di copie multiple in tandem Utilizzo: permettono la produzione di animali transgenici per produzione farmaci o quali modello di malattie umane Svantaggi: Inserzione ectopica Scarsa efficienza di integrazione Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale

Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile Stimolazione dell’ovulazione in una femmina Appena dopo l’accoppiamento prelevato ovulo fecondato, microiniezione di DNA con il transgene (circa 200 copie) iniettato all’interno del pronucleo maschile (fatto su 20 -30 ovuli fecondati) Gli ovuli microiniettati vengono impiantati nell’utero di una madre adottiva resa pseudogravida da maschio vasectomizzato. Dopo 3 settimane: progenie e analisi. Alcuni nati saranno transgenici. L’animale è transgenico perché il transgene è presente in tutte le cellule

Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile di DNA libero Inserzione ectopica (accoppiata con maschio vasectomizzato)

Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile di DNA libero Si microiniettano molti oociti fecondati (circa 200 oociti da 7 -8 femmine dopo induzione superovulazione) Da ogni oocita fecondato si sviluppa un topo Individuazione topo transgenico

Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile

LA GHIANDOLA MAMMARIA COME BIOREATTORE - Ha una densità cellulare di 1000 volte superiore ad un fermentatore - Produce fino a 10 g/l di proteina transgenica - Una pecora produce 250 -280 litri ogni ciclo di lattazione - E’ più economico dei comuni fermentatori - Produce corrette modificazioni post-traduzionali - Facile la purificazione (nel latte ci sono poche proteine) Clonaggio a monte di un promotore espresso nella ghiandola mammaria (caseina, -lattoglobulina)

PROTEINE PRODOTTE IN FLUIDI BIOLOGICI DI ANIMALI USATI COME BIOREATTORI Esempio: produzione di Fattore VIII umano nel latte del maiale. Il c. DNA umano completo a valle del promotore del gene della proteina acida del siero del latte di maiale. Sintesi di fattore VIII nel tessuto mammario del maiale e secrezione della proteina nel latte Problematiche: - Alta inefficienza del metodo di microiniezione nei pronuclei (in genere non più del 5% degli oociti iniettati dà progenie transgenica.

Tecnologia del trasferimento nucleare Riprogrammazione del nucleo che ripercorrerà l’intero sviluppo

Tecnologia del trasferimento nucleare Clonazione animale: la creazione di Dolly

Tecnologia del trasferimento nucleare Dolly, primo esperimento riuscito di clonazione animale (1997) Problematiche della clonazione animale: - Alta inefficienza dei metodi di trasferimento nucleare - Alta frequenza di malattie congenite negli animali - Invecchiamento prematuro degli animali - Considerazioni etiche del pharming soprattutto nelle piante (OGM).

Problematiche della clonazione animale Differenze dovute a fattori epigenetici e ambientali: colore del mantello, personalità. Studi con microarray di espressione su tessuti di animali e loro cloni: centinaia di geni con espressione anormale. La riprogrammazione del nucleo determina alta non vitalità dei cloni o forte alterazione dell’espressione genica