Produzione di Acido Lattico da batteri processo standard
Produzione di Acido Lattico da batteri (processo standard): 1. Aumento acidità inibizione del metabolismo 2. Aggiunta di base (Ca(OH)2) p. H neutro 3. Aggiunta di acido alla fine del processo (H 2 SO 4) acido lattico indissociato 4. Smaltimento sale (Ca. SO 4) Uso di organismi resistenti a basso p. H evito 2. 3. e 4. riduco le spese di processo Candidato: lievito Saccharomyces cerevisiae ingegnerizzato con LDH Problemi: • Fermentazione ‘eterolattica’ (etanolo e acido lattico) • Catabolismo del glucosio e geni PDC
METABOLISMO DEL GLUCOSIO E DEL PIRUVATO IN LIEVITO ALTRE FONTI C GLUCONEOGENESI RESPIRAZIONE biosintesi
USO DEL LIEVITO Kluyveromyces lactis Organismo Crabtree – negativo Un solo gene PDC (Kl. PDC 1)
I ceppi klpdc 1 crescono come il selvatico su glucosio
IMPORTANZA DEL BYPASS DEL PIRUVATO E DEL TRASPORTO DELL’Acetil Co. A
Kl. PDC 1 è indotto da glucosio e represso da etanolo • 1 = YP • 2 = YP Glucose • 6 = YP Ethanol
Kl. PDC 1 è soggetto ad autoregolazione da Kl. Pdc 1 p
Meccanismo dell’autoregolazione Cellula selvatica Lac. Z Cellula klpdc 1 Lac. Z R Kl. PDC 1 klpdc 1
VETTORE D’ESPRESSIONE per Lattico Deidrogenasi
METABOLISMO DEL PIRUVATO NEI CEPPI METABOLICAMENTE INGEGNERIZZATI
wt strain: • ethanol • lactate 84. 8 m. M 47. 7 m. M Klpdc 1 strain: • ethanol 0. 0 m. M • lactate 126. 5 m. M
PRODUZIONE Ceppo Lattato Etanolo Acetato Resa lattato Attività LDH PM 6 -7 A 0 161 0. 5 0 0 PM 6 -7 A + p. EPL 2 47. 7 84. 4 0. 3 0. 17 4 -5 PMI/C 1 0 0 1. 7 0 0 PMI/C 1 + p. EPL 2 126. 5 0 0. 3 Concentrazioni in m. M Resa molare per glucosio (massima resa teorica = 2) Attività in U/mg proteina cellulare 0. 46 55 -60
Produzione in bioreattore (14 litri) Terreno industriale (CSL) Glucosio 50 g/l (+ feeding) Areazione 2 l/min p. H costante (4. 5 unità) 109 g/l (1. 2 M) acido lattico Produttività 0. 795 g/l ora
Produzione in condizioni di p. H controllato condizioni g/litro totale Resa molare p. H finale Acido % Acido g/litro p. H costante 4. 5 tamponato 109 1. 19 4. 5 19 20. 7 p. H iniziale 4, parzialmente tamponato 35 0. 88 3. 0 88 30. 8 p. H iniziale 5, non tamponato 29 0. 7 2. 8 92 26. 7 Porro D et al. Replacement of a metabolic pathway for large –scale production of lactic acid from engineered yeasts (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65: 4211 -4215
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