PRMBAJTJA Zhvillimi bioteknologjis molekulare Metodat e studimit t

PËRMBAJTJA � Zhvillimi bioteknologjisë molekulare � Metodat e studimit të qelizave ü Teknika e veçimit me centrifugim ü Kromatografia ü Elektroforeza e proteinave ü Përcaktimi i peshës molekulare me anë të elektroforezës ü Elektroforeza e acideve nukleike ü Detektimi ADN-së ü Hibridizimi i acideve nukleike

Zhvillimi bioteknologjisë molekulare � m. o dhe qelizat eukariote si “fabrika biologjike” për prodhimin e lëndëve të tilla si insulina, interferoni, hormin i rritjes, antigjenet vilare, dhe një sërë proteinash � Bimët dhe kafshët janë shndërruar në bioreaktorë natyralë që prodhojnë proteina nga gjene të reja ose të ndryshuara � Vënia e teknologjive të reja gjenetike-molekulare në shërbim të bioteknologjisë, çoi në lindjen e një drejtimi të ri rq quajtur Bioteknologji Molekulare

Disiplinat që kontribuojnë në zhvillimin e bioteknologjisë molekulare dhe klasat kryesore të produkteve që jepa ajo � Biologjia molekulare mikrobiologjia biokimia gjenetika inxhineria gjenetike BIOTEKNOLGJIA MOLEKULARE USHQIM Medikament mjedis vaksina diagnostike blegtori

Historiku i zhvillimit të BT molekulare � 1943 penicilina prodhohet në shkallë industriale � 1944 Avery, Mc. Carty vërtetuan se ADN-ja është materiale gjenetik � 1953 Watson dhe Crick përcaktuan strukturën e ADN-së � 1966 Deshifrohet kodi gjenetik � 1970 Izolohet enzima e parë e restriksionit � 1973 Boer dhe Kohen stabilizojnë teknolgjinë e ADN-së rikombinante � 1978 Genetech prodhon insulin e njeriut në E. Coli

BT molekulare � 1981 – prodhohet sekuencatori i parë automatik i ADN-së � 1988 – publikohet metoda e PCR � 1990 – në SHBA jepet leja përdorimin e metodave të terapisë gjenike në qelizat somatike � 1997 klonimi i deles Doly � 2000 -2001 sekuencimi i gjenomit human

Metodat e studimit të qelizave � Metodat e reja të biologjisë molekulare kanë ndikuar në njohjen e ndërtimit, funksionit dhe të mekanizmave rregullues qelizorë Konsiston nw : � Vecimin e pjesëve të ndryshme qelizore � Teknikat: centrifugimi, kromatografia, elektroforeza

Teknika e vecimit me centrifugim � Fillimisht suspensioni qelizor trajtohet mekanikisht, bluhet, formohet ekstrakt qelizor � Ekstrakti qelizor, nënshtrohet centrifugimit, fillimisht me numër të vogël rrotullimesh � Meret një sediment kryesisht nga mbetje të rënda, ndërsa pjesa e lëngët supernatanti përmban fragmente më të lehta mebrana, ribozome etj. � Supernatanti centrifuhoehet më tej për të vecuar përbërësit e tjerë, me anë të ultracentrifugave, shpejtësi shumë e lartë dhe në të temp. të caktuara ftohes +4 Gradë, që nuk lejon dëmtimin e pjesëve qelizore, nga nxehtësia e prodhuar.

Teknika e vecimit me centrifugim

Metoda e studimit dhe karakterizimit të proteinave � Teknika e ndarjes: Ultracentrifugimit të një përzierje proteinash (ADN) në një gradient saharoze, ku përqëndrimi tij (saharozws) është më i ulët në anën e grykës së epruvetës dhe më i lartë në anën e fundit të epruvetës. � Me anë të centrifugimit të përzierjes proteinike për një kohë të gjatë në një gradient të tillë proteinat zhvendosen migrojnë në masë të ndryshme sipas peshës së tyre; ato ndalen në atë nivel ku densiteti i tyre përputhet me densitetin e saharozës në të njëjtin nivel. � Formohen shtresa (unaza) në tub dhe mund të vecohen me anë të kullimit.

Metoda e studimit dhe karakterizimit të proteinave

Metoda kromatografike � Ndarja e lendeve me metode kromatografike bazohet nw ndarjen e ndryshme tw lendeve midis dy fazave tw sistemit : fazws tw palevishme (stacionare) dhe fazes te levizeshme (mobile) � Procesi i ndarjes se lendes bazohet ne njw nga parimet fizikale: adsorbim, ndarja bazuar ne madhesoine e molekulave, si dhe kembimit jonik

kromatografia Teknikë për ndarjen e proteinave nga një ekstrakt qelizor � Kromatografia në kollonë është më e përdorshmja për fitimin në gjendje të pastër të proteinave. � Aparati kromatografik përbëhet nga një kollonë qelqi që mbushet me një lëndë të ngurtë të përshkueshme, me molekula me përmasa të ndryshme, e zhytur në një tretës të caktuar � Nga ana e sipërme shtohet përzierja që duhet të ndahet , dhe kalon përmes matriksit që mbush kollonën. � Parimi i ndarjes së proteinave është ndryshëm; ato mund të ndahen në bazë të; përmasës së tyre, të ngarkesës elektrike, ose lidhen në mënyrë specifike me lëndë “kapëse” që ndodhen në matriksin e kollonës �

kromatografia � Kjo e fundit quhet kromatografia me afinitet dhe për këtë zakonisht përdoren enzima specifike për proteinën që kërokohet të vecohet. � Në një hap të dytë me anë të tretësve ose të lëndëve specifike bëhet ndarja ose shkëputja e enzimave nga proteina. � figura

Elektroforeza e proteinave është një tjetër metodë për ndarjen e fraksioneve qelizore sidomos të proteinave dhe acideve nukleike � molekulat migrojnë në një fushë elektrike sipas ngarkesës së tyre, përmasave dhe formës � Për përcaktimin e peshës molekulare, proteina fillimisht denatyrohet me nje detergjent dhe më pas i nështrohet elektroforezës. � Proteinat lëvizin nën fushën elektrike të drejtuara nga përmasat � � Duke matur masën e levizjes së një proteine apo të një përzierje proteinash në raport me një proteinë standarte me parmasa të njohura

Përcaktimi i peshës molekulare me anë të elektroforezës

Proteini šećerne repe�� A - razdvojeni SDS-PAG elektroforezom, B 2 D elektroforezom (M. Krsnik-Rasol������ D. Pavoković)

Përcaktimi i peshës molekulare me anë të elektroforezës � Ku ngarkohen (loading) proteinat e denatyrura ? Në zhel poliakrilamid ose në agar � Pas elektroforezës zheli ngjyroset me ngjyrues specifik për proteinat që bën të mundur vizualizimin e bandave të proteinave të ndara, kështu përcaktohet masa molekulare e tyre (shiko figuren lartë). � Proteinat mund të ndahen edhe varësi të ngarkesës së tyre elektrike, kjo ngarkesë shprehet me anë të pikës së tyre izoelektrike d. m. th vlera e p. H ku proteinat nuk kanë ngarkesë elektrike

Përcaktimi i peshës molekulare me anë të elektroforezës quhet: teknika e fokusimit izoelektrik, ku proteinat lëvizin në një gradient p. H, d. m. th cdo proteinë lëviz dhe ndalet në zhel në pikën ku vlera e p. H përputhet me atë izoelektrike të proteinës (pra në p. H ku nuk ka ngarkesë elektrike) Me këtë elektroforezë mundësohet ndarja e përzierjeve që përmbajnë deri në qindra ose mijëra proteina të ndryshme, p. sh ekstarktet qelizore � Teknika

ZHEL ELEKTROFOREZA ME AGAROZё Çfar pёrfaqёson elektroforeza? � Zhel elektroforeza me agarozё ёshtё metoda qё shfrytёzohet nё biokimi dhe biologjinё molekulare pёr tё fraksionuar molekulat e ADN, ARN-sё sipas madhёsisё sё tyre nё çb (çifte bazash nga 20 -30 kb). Kjo realizohet duke migruar molekulat e ngarkuara negativisht tё acideve nukleike pёrmes njё matriksi agaroze nёn veprimin e fushёs elektrike (electrophoresis). Fragmentet e shkurtёra lёvizin mё shpejt dhe migrojnё mё gjatё se fragmentet gjata. Sambrook J, Russel Dё (2001)

Nxjerrja dhe fitimi ne gjendje te paster te ADN-se � Metodat e studimit të acideve nukleike � Ekstarktimi I ADN-së � Trajtimi e qelizave me enzima (proteinaza K), që tret membrabat qelizore, dhe me ARN-azë � Metoda Fenol-kloroform � Ekstraktohet ne fund me etanol 96% � Në fund centrifugohet, 16000 rot/25 min, fundrina pra ADN-ja tretet me tris EDTA ose me H 2 O te distiliuar

Nxjerrja dhe fitimi nw gjendje tw pastwr tw ADN-sw

Detektimi ADN-së � Spektrofotometria- veti e ADN-së për të thithur rrezatimin UV në gjatësinë 260 nm, kjo thithje I dedikohet bazave purin dhe pirimidine � Zinxhiri I dyfishtë ka absorbancë më të ulët se zinxhiri I njëfishtë � Centrifugimi I AND-së në gradient të Cs. Cl,

Centrifugimi I AND-së në gradient të Cs. Cl, Molekulat e AND-së kanë densitet të ndryshëm, � Ciftet G-C në raport me ato A-T kanë një densitet më të lartë se A-T � Ky densitet i molekulave të AND-së mund të përcaktohet me anë të centrifugimit të saj në shpejtësi shumë të larta në një gradient të Cs. Cl � Solucioni I ADN-së shtresëzohet mbi një solucion të Cs. Cl, dhe centrifugohet në një shpejtësi të lartë deri sa të arrihet gjendja e ekuilibrit � Cs. Cl formon një gradient në rritje nga filimi deri në fund të epruvetës, ndërkohë mol. E AND-së pozicionohen ndaken në atë të përqëndrimit të Cs. Cl që përputhet me densitetin e tyre �

Centrifugimi I AND-së në gradient të Cs. Cl, � Kur molekulat e ADN-së kanë densitet të ndryshëm, në ekuilibër do të meren një sërë bandash të ADN-së, ku më e rënda migron më shumë ndërsa me e leha më pak � Më pas në solucion shtohet Br. Etidiumi dhe bandat e ADN-së bëhen të dukshme me shtresa flouroshente, kur epruveta shihet nën rreze UV. � Me anë të thithjes, bandat mund të tërhiqen në formë të vecuara nga njëra tjetra

Elektroforeza nw zhel e AND-sw Si duket sistemi elektroforezёs

Elektroforeza në zhel e ADN-së � elektroforeza

ZHEL ELEKTROFOREZA ME AGAROZё � kualitetin e ADN-sё sё izoluar nga indet tumorale dhe jotumorale detektohet me anё tё zhel elektroforezёs agarozё zakonisht me pёrqёndrim 2%.

Detektimi i ADN-së me anë të fluoreshencës � AND-ja kur trajtohet me ngjyrues fluoroshent , vërehet falë fluoroshencës së këtyre ngjyruesve specifike � Bromuri i etidiumit, kancerogjen, nderfutet ne strukturën e ADN-së � Nëse shikohet nën UV rreze, bandat (shiritat) e saja behen te dukshme � figura

Standarti Ose markeri

Radioaktivizimi i acideve nukleike Radioaktiviteti përdoret shumë në fushën kërkimore të acideve nukleike � Acidet nukleike të radioaktivizuara mund të detektohen me anë të autoradiografisë � Rrugët pqr shënimin radioaktiv të acideve nukleike: Ø Ndërfutja e fosfatit radioaktiv, gjatë kryerjes së sintezës së acideve nukleike (sintetizohen zinxhirë radioaktive) P 32 Ø shtimi I ATP-së radioaktive në fund të AND-së, më anë të enzimës polinukleotid-kinaza, ku fosfati I trete I ATP, transferohet në grupin OH të skajit 5’ të mol, së AND-së Ø Shënimi qëndror me anë të sintetizimit in vitro në prani të nukleotideve radioaktive �

Efekti I temp. mbi acidet nukleike � Me nxehje prishen lidhejt hidrogjenore � Ngrohja con në denatyrim I ADN-së � Sa më fortë mbahen vargjet me njëri tjetrin aq më e fortë duhet të jetë tepm. e denatyrimit � Në këtë veti ndikon përmabjtja relative A-T / G-C, duke ditur që ciftet A-T kanë dy lidhje hidrogjenore, dhe G-C tre lidhje të tilla. � Prishja e vargjeve të ADN-së mund të ndiqet me anë të ndryshimit të absorbancës së saj, (spektro) � Me rritjen e temp, absorbanca ka ulje, maximumi I absorbancës kur vargjet janë ndarë plotëshit � Me uljen e Temp, ADN-ja fillo të rinatyrohet

Hibridizimi i acideve nukleike � Hibridizimi i ADN-së, ndërimi I vargjeve të dyfishta nga një zinxhirë primar � Rinatyrimi I AND-së � Mund të formohen cifte ADN_-AND, ARN-ARN � Teknikë për njohjen e gjeneve � Bën të mundur kapjen apo identifikimin e nje fragmenti të interesit � Kapja bëhet me anë te fragementeve që u njihet radhitja SONDA, � Sondat radioaktive, � Hibridizimi mund të behet edhe poas një elektroforeze ne zhel

fund � fund