Principii fundamentale privind Testele de Coagulare Robert Gosselin

Principii fundamentale privind Testele de Coagulare Robert Gosselin, CLS Universitatea din California, Departamentul de Sănătate din Davis Departamentul de Patologie şi Medicină de Laborator din Sacramento, CA Robert. gosselin@ucdmc. ucdavis. edu

Scopuri şi Obiective • Primul şi cel mai vulnerabil … – Scurtă trecere în revistă a hemostatelor – Aspectele tehnice ale testelor de laborator • Metode • Restricţii • Materialele din afara laboratorului • Prezentările ulterioare – Stările de boală şi testele de laborator pentru Dx • Analize, studii de caz, şi obiecţii cu privire la testele de laborator …

Scopuri şi Obiective • Sugerate de către personalul medical intern… – Ce doleanţe aveţi? – De ce aveţi nevoie? – Discuţii şi adresarea întrebărilor …

Hemostază • Celulară – Endoteliu – Trombocite – Eritrocite – Leucocite • Fluidică – Factori şi regulatori procoagulanţi – Factori şi regulatori fibrinolitici

Rolul endoteliului • Procoagulant – Colagen – Fv. W stocat în corpusculii WP – Prezentarea factorului tisular – Citokine/chemokine

Rolul endoteliului • Anticoagulant – Sulfat de heparină – În prezenţa trombinei • Producere de Prostacylcin Agregare PLT • Oxid nitric - dilatare a vaselor Agregare PLT • Trombomodulina express Producere de trombină • Emitere de TFPI Producere de trombină • Emitere de activatori de plasminogen Fibrinoliză ce va contribui la vindecarea rănii

Citokine / Chemokine • • • TNF-α IL 1 -β Expresia TF IL-6 IL-8 CD 54 – moleculă de aderare transmembranară pentru a facilita circulaţia leucocitelor spre endoteliu • CD 62 E şi CD 62 p – proprietăţi de aderare • Complementare – C 3 a C 5 a determină emitere de IL din endoteliu – C 3 a: C 4 a. C 5 a determină emitere de elastază

Componente celulare • Trombocite – Receptori • Adeziune • Agregare • Factori – Intracelular • Adeziune • Factori procoagulanţi

AD Shapiro, WFH 1999; 19

Rolul trombocitelor TF expunerea colagenului Expunere de P selectin Adeziunea Monocitelor Fv. W-GPIb-IX GPIIb-IIIa CR Trombocit Fbg IX X V II Emitere de ATP, ADP TF serotonin, B-TG Fbg, Trombină

Componente celulare • Eritrocite – Facilitează circulaţia trombocitelor spre celulele endoteliale – Constituie sursa de Tromboplastină • Leucocite – Prezintă factor tisular -MC – Prezintă Citokine – Produc Elastază – PMN

“Cascadă” Revizuită Factor tisular VIIa-TF X VIIa-TF IX IXa neutralizat VIIa-TF-Xa XIa VIIIa Xa VIII TFPI V Va Protrombina Trombina F 1. 2

Emitere de Citokine TROMBINA Procoagulant Separarea Fibrinogenului: generaţia monomerilor de fibrină Activează factorii VIII şi V Anticoagulant Complex cu trombomodulină: activarea proteinei C Generează TAFI: inhibitor de fibrinoliză Provoacă agregarea trombocitelor Activează factorul XIII Emitere de celule endoteliale a t. PA

Trombină XIII Fibrinogen Fibrină XIIIa FDP Fibrină stabilizată Plasminogen u. PA sau t. PA Plasmină u. PAR FDP u. PAR: u. PA COAGULIZARE MMP Degradare extracelulară D-dimer

D E FIBRINĂ E D D D Plasminogen t. PA D D-dimer Plasmină u. PA FIBRINOGEN D D E D Fragmentul X Fragmentul Y D Fragmentul D E Fragmentele D şi E

HMWK Pre “Cascadă” Tradiţională XIIa XI XIa IX VIII Ca+2 IXa VII TF PF 4 Ca+2 VIIIa X Xa V Va PF 4 Ca+2 Protrombină Trombină F 1. 2 Fibrinogen Fibrină FPA FPB

HMWK Pre XIIa XI IX VIII Regulatori Primari de Coagulare AT XIa Ca+2 IXa VIIIa VIIa PS TF C 1 Inh PF 4 Ca+2 HCFII TFPI Xa X V PC VII Va Protrombină Fibrinogen 2 -MG PF 4 Ca+2 Trombină Fibrină

Trombină XIII Fibrinogen Fibrină XIIIa FDP Plasminogen u. PA or t. PA u. PAR Fibrină Stabilizată PAI-I TAFI 2 -AP 2 -MG Plasmină FDP u. PAR: u. PA COAGULIZARE MMP Degradare extracelulară D-dimer

Testele privind funcţia endotelială • “Nada”… – Toate măsurile indirecte • Factori solubili – Fv. W, Endotelial-1 – Citokine

Testele privind funcţia leucocitelor şi eritrocitelor • Leucocitele – Evaluare indirectă • Factori solubili • Citometrie de flux – Se agregă – Produce citokine • Eritrocitele • HCT

Testele privind funcţia trombocitelor • Adiţional numărului nelimitat de teste – Testarea funcţiei trombocitelor • Metodele Screening – PFA şi altele • Metodele de Agregare – Sânge integral versus PRP (plasma bogată în trombocite) • Citometrie de flux – Diverse posibilităţi … » Gradul de receptare a medicamentelor “Drug occupancy” » Activare

Evaluarea Funcţiei Trombocitelor • • Chronolog Corporation – Metoda de impedanţă a unui singur canal Dade Behring Incorporated – Agregare provocată de viteză Medtronics – ACT (timp de coagulare activat) modificat ce utilizează PAF (factor de activare a trombocitelor) Accumetrics – Detectare optică a particulelor de fibrinogen Hemadyne Forţa contractilă a trombocitelor Helena – “Plateletworks” -modificări în impedanţă (2 tuburi) Diamed – “Cone and Plate(let)” – test de predicţie a hemoragiei la pacienţii trombocitopenici

Principiu de lucru al PFA-100® Rezultatele sunt raportate ca “Timp de încheiere” în secunde

Metodele funcţionale de coagulare • Detectarea cheagului – Metoda Screening versus cea specifică • d. e. a. PTT versus factorul VIII – Detector de lumină (dispersează particulele) versus cel mecanic • Metoda cromogenică • Metoda imunologică

Metodele de coagulare de tip antigen • ELISA • Electroforeză • Metoda imunologică

Testele de Coagulare în Laboratoarele Clinice Timpul de Protrombină (PT) Plasma PP + Activator (+ Ca. Cl 2) Detectarea Cheagului 37 o. C Timpul de tromboplastină parţială activată(a. PTT) Plasma PP + Activatori Metode optice: modificare în turbiditate Ca. Cl 2 Detectarea Cheagului 37 o. C Metode mecanice: modificare în mişcare

densitate optică Testele în bază de Cheag timp

REPREZENTAREA GRAFICĂ A S NGELUI (Nesatisfăcătoare) Activare mărită Reţineri în timpul testului: densitate optică emitere de PF 4 Nivelele factorilor Factorul VIII Fibrinogen Tratament medicamentos Fxs DDAVP PCCs time Novo 7 Alimente (d. e. cofeină) Practicarea sportului Stres (Fiziologic)

densitate optică Activitate a factorului Reprezentare grafică a sângelui (nedorită): Medicamente- UFH, DTI, Xigris Consumare a factorilor Lipemia, icterus Reţineri în decursul testului: +/- Anticoagulant Lupus Inhibitori Activitate a Fx VIII timp

Activitatea Anti-Xa plasmă [heparină] + antitrombină exogenă Exces de f. Xa Complexul AT-heparină-Xa + f. Xa rezidual Substrat cromogenic colorare în galben

HIT Ig. G (+) anticorpi Ig. G Anticorp anti-uman conjugat ¤ Spălare Microrezervor ce conţine antigen-ţintă: complexul PF 4 -heparină + ¤ ¤ ¤ ++ + Incubare Test Chromogenic Spălare ¤ + ¤ + Incubare Colorare Cantitatea de culoare trebuie să fie proporţională cu cantitatea de anticorpi prezenţi Reagenţi acoperiţi cu anti-Fv. W al pacientului Rezervor de testare Incubare Citirea instrumentului — modificări în densitatea optică

Validarea testului

XII HMWK Pre XIIa XII XI XIa VII XI Ca+2 TF IX VIII IXa VIII VIIa PF 4 Ca+2 VIIIa X X Xa V VII IX Va Protrombină V PF 4 Ca+2 II Trombină Fibrinogen a. PTT Fibrină PT

a. PTT • Determinarea deficienţelor factoriale • Monitorizarea efectelor provocate de medicamente: – UFH – DTI – Factorii VIII şi IX substituitori ai Rx • Altele – LA

PT/INR • Deficienţă factorială • Monitorizare medicamentoasă – Antagonistul vitaminei K (oral) • Caracterul variabil al efectului al UFH Rx – Majoritatea prezintă efect ce nu depăşeşte mai mult de 1. 0 U/ml Anti-Xa • Efect variabil al LA

Fibrinogenul cantitativ se extrapolează utilizând timpul de coagulare obţinut trasat împotriva unei curbe de calibrare Fibrinogen: cu reagent de trombină concentrat , cu efect de UFH nu mai mare de 2. 0 U/ml Timpul de trombină : cu reagent de trombină diluat , via test alternativ de monitorizare a UFH sau DTI la pacienţi cu linie de bază ridicată a a. PTT (pre-tratament)

Influenţă asupra testului de coagulare • Preanalitică – In-vivo – Ex-vivo • Analitică

Variabile preanalitice • Mostra de sânge – Prea puţin versus prea mult – Prea lung – Flebotomie dificilă – 3. 2% versus 3. 8% de soluţie-tampon de citrat de sodiu – Flebotomie versus trasări de linie – Succesiunea eprubetelor? ? – Efecte neintenţionate: • Medicamente • Alte manifestări nonpatologice, d. e. stres, dietă, contraceptive orale şi alte schimbări hormonale, etc

Variabile analitice • Utilizarea instrumentelor/utilajului – Detectarea optică versus cea mecanică a cheagului • Afectată de intervenţii – lipemia, bilirubinemia, etc. • Reagenţi – Sursa de PT (recombinant, extract din creier, etc) – a. PTT • activator • concentrat şi sursă de fosfolipide • destinat pentru heparină, factorii VIII şi IX, poss LA

Expunere sumară • Majoritatea testelor de coagulare screening sunt neprelucrate de natura lor • Toate rezultatele privind coagularea trebuie interpretate cu atenţie până când variabilele preanalitice şi analitice vor fi excluse, pentru a preveni rezultate pozitive/negative false • Succes în procesul de validare …