Preparation of MiniScale Plasmid DNA detection of subcloning

Preparation of Mini-Scale Plasmid DNA & detection of subcloning 생화학 실험 (2) 담당교수 : 하상준 교수님 담당조교 : 이수영 조교 홍석봉 조교

Contents 1. Component of Plasmid vector 2. Plasmid and bacterial culture 3. Plasmid purification methods 4. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Mini-preparation 5. Restriction enzyme reaction & detection of subcloning!!

Component of Plasmid vector GST p 53 HA p 53

Plasmid and bacterial culture Colony picking 37℃ 15 h incubation Lysis & prep.

Plasmid purification methods

Alkaline lysis Method Suspension (single cell) Lysis & denatruration Renaturation or neutralization (Solubilization of Plasmid DNA) Recovery of plasmid DNA

DNA preparation By Alkaline lysis Method

Materials LB medium – for cell culture Meterials 2 ml of LB medium Antibiotics Transformed bacteria Resuspension Buffer - Solution I 50 m. M glucose 25 m. M Tris-Cl p. H 8. 0 10 m. M EDTA, p. H 8. 0 Lysis Buffer - Solution II 0. 2 N Na. OH 1%(W/V) SDS Neuralization Buffer - Solution III 3 M Potassium acetate Glacial acetic acid

DNA Mini-prep. Quick guide Using DNA mini prep. kit

DNA Mini-prep. Quick guide 1. Transformation한 plate에서 colony를 따서 2 ml LB(+antibiotics)에 12 -15시간 동안 37℃ shaking incubator에서 키운다. 2. 2 ml의 LB+Bacteria를 e-tube에 1 ml씩 분주하여 12000 rpm 30 sec. Centrifuge진행한다. 3. Centrifuge 진행 후 상층액은 pipet으로 따서 버리고, 남은 1 ml 역시 똑같이 진행한다. 4. E-tube에 bacterial pellet만 남기고 완전히 상층액을 제거한 후, Resuspension buffer를 250㎕ 첨가한다. Pellet이 완전히 풀릴 때까지 pipetting한다. 5. Lysis buffer를 250㎕ 첨가하고, inverting 하여 섞어준다. RT(상온)에서 3 min. Incubation. 6. Neutralization Buffer를 350㎕ 첨가하고, inverting하여 섞어준다. 5 min. Incubating on ICE!!! 7. 4℃에서 12000 rpm으로 10 min. Centrifuge 진행. 그 사이, column과 collection tube 준비.

DNA Mini-prep. Quick guide 8. Column을 collection tube에 끼우고 12000 rpm, 1 min. Centrifuge 진행. 9. Collection tube에 모인 buffer를 버리고, washing Buffer A를 column에 500㎕ 첨가. 10. 12000 rpm, 1 min. Centrifuge 진행. Collection tube의 buffer를 버린다. 11. Column에 washing buffer B를 600㎕ 첨가. 12000 rpm, 1 min. Centrifuge 진행. Collection tube의 buffer를 버린다. 13. 빈 column을 collection tube에 끼우고 12000 rpm, 1 min. Centrifuge진행하여 column에 남아있는 잔여 buffer를 완전히 제거한다. 14. Column을 새로운 e-tube에 끼우고 elution buffer 30㎕를 filter에 정확히 dropping한다. (filter를 tip으로 찌르지 말 것!!!) 1 min. RT incubation. 15. 12000 rpm, 1 min. Centrifuge 진행. Tube에 모인 buffer에 plasmid DNA 포함.

Confirmation of subcloning * 제한효소(restriction enzyme) 반응 클로닝(cloning)이 제대로 되었는지 확인하기 위해 형질전환(transformation)된 대장균에서 추출한 plasmid DNA를 제한효소로 잘라 electrophoresis(전기영동)하여 확인한다. Mini prep. product 5. 0㎕ 10 x. Buffer 2. 0㎕ 10 x BSA 2. 0㎕ Eco. R I 1. 0㎕ Xho I 1. 0㎕ 증류수 9. 0㎕ 합계 20㎕/sample

Confirmation of subcloning Gel loading ① ② ③ ④ ⑤ … ① DNA size marker ② uncut DNA sample(HA-p 53) ③ 제한효소 처리한 HA-p 53 DNA sample ④ 제한효소 처리한 mini prep. DNA sample 1 ⑤ 제한효소 처리한 mini prep. DNA sample 2. . .

Confirmation of subcloning 3 2 ct ct u u d d od pro ro r p. p. p e e e r r r 3 p ip i p ini p 5 n n i i m m m HA 53 r g g e p g g k n n A tin utti ar tti tin t H t u M c c cu cu ng e e i ze e e t i t s ym ym cu z z A z z En En DN En Un En t uc 1

Confirmation of Purified DNA

Question ① DNA mini prep. 과정에서 Resuspension Buffer, Lysis Buffer, Neutralization Buffer 의 역할을 설명하십시오. ② DNA prep. 과정에서 사용하는 Neutralization solution에는 3 M potassium acetate가 포함됩니다. 현재, 실험실에는 molecular weight이 98. 15인 potassium acetate가 있습니다. 이를 이용하여 Neutralization solution을 400 ml 만들려면 몇 g의 potassium acetate가 필요합니까? 계산하여 증명하고, 설명하세요. ( 소수점 첫째 자리까지 표기 ) ③ sub-cloning(1)~(3)의 전체 진행과정을 간략하게 정리해 보십시오

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