PREPARACIONES MICROSCPICAS Y OBSERVACIONES DIVERSAS 1 INTRODUCCIN A

PREPARACIONES MICROSCÓPICAS Y OBSERVACIONES DIVERSAS

1. - INTRODUCCIÓN A LA VISUALIZACIÓN DE MICRORGANISMOS. • 1. 1 - REQUISITOS DE UNA PREPARACIÓN PARA LA OBSERVACIÓN CON EL MICROSCOPIO ÓPTICO. • 1. 2 - CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE VISUALIZACIÓN DE MICROORGANISMOS EN MICROSCOPIA ÓPTICA. • 1. 3 - CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS SEGÚN SU VISIÓN AL MICROSCOPIO. 2. - VISUALIZACIÓN “IN VIVO” • 2. 1 - TÉCNICA • 2. 2 - EXAMEN EN FRESCO • 2. 3 - GOTA PENDIENTE

3. - OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS MUERTOS. TINCIONES • 3. 1 - TÉCNICA GENERAL DE TINCIÓN • 3. 2 - FACTORES QUE INFLUYEN EN LA TINCIÓN • 3. 3 - PREPARACIÓN DE LOS COLORANTES • 3. 4 - MATERIAL EN LAS TÉCNICAS DE TINCIÓN • 3. 5 - TINCIONES • TINCIÓN NEGATIVA • TINCIÓN SIMPLE • TINCIONES DIFERENCIALES • TINCIONES ESTRUCTURALES

CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE VISUALIZACIÓN DE MICROORGANISMOS EN MICROSCOPIA ÓPTICA MICROORGANISMOS VIVOS SIN COLOREAR SIN FIJACIÓN PREVIA EXAMEN EN FRESCO ENTRE PORTA Y CUBRE GOTA PENDIENTE EN PORTA EXCAVADO TINCIÓN NEGATIVA TINCIÓN SIMPLE MICROORGANISMOS MUERTOS CON FIJACIÓN TINCIONES COMPUESTAS TINCIONES DIFERENCIALES GRAM ZHIELNEELSEN TINCIONES ESTRUCTURALES FLAGELOS CÁPSULAS ESPORAS

MORFOLOGÍA BACTERIANA

VISUALIZACIÓN “IN VIVO” • Muestras delgadas o transparentes • Líquidos con p. H fisiológicos • Ventajas: se aprecia mejor la – Morfología – Agrupación – Motilidad • Inconvenientes: – Poco contraste – Manejo engorroso (materia viva, contaminante)

TÉCNICA • Utilización del microscopio • Soporte de los microorganismos: – suero fisiológico (mantiene la vitalidad) – solución de KOH (aumenta la refringencia) – agua marina, agua dulce, clara de huevo. . • Evitar la desecación (sellado)

EXAMEN EN FRECO • Objetivos: descritos anteriormente. • Técnica: – – – Limpiar porta Colocar vaselina Depositar gota Colocar cubre Observar al M. O. • Ventajas: – Rapidez – Evita las distorsiones ópticas de portas excavados. • Desventajas: – Poco contraste – A veces necesita cámaras para observar la motilidad. Infusiones de hojas (cocos y parásitos), sarro dental (espiroquetas), Yogur (bacilos)

OBSERVACIÓN DE BACTERIAS EN FRESCO

GOTA PENDIENTE Técnica: a. - Limpiar porta excavado y cubre. b. - Círculo de vaselina en el cubre c. - Muestra en el cubre d. - Se coloca el portaobjetos e. - Se da la vuelta y se observa Ventajas: se deseca manos Desventajas: más lento y Engorroso.

TINCIONES. TÉCNICA • • • Extensión Desecación Fijación Tinción Lavado Secado

FACTORES QUE INFLUYEN • Pureza de colorantes y reactivos • Concentración del colorante (0, 2 -2%) • p. H de la solución del colorante: – Ácidos: eosina, azul de metilo, fucsina ácida – Básicos: fucsina básica, azul de metileno, verde malaquita, violeta de genciana – Neutros • Temperatura • Sustancias adicionales • Tiempo de tinción

PREPARACIÓN DE COLORANTES • • Se disuelven mal en agua y bien en alcohol. Debe pulverizarse. Muy cuidadosos con las concentraciones. Dejarlos reposar antes de usarlos (24 h). Filtrarlos Etiquetarlos (fecha, composición. . ). Filtrarlos si aparecen precipitados.

MATERIAL PARA TINCIONES • • Portas y cubres Asas de siembra Mechero Microscopio Cuentagotas o pipetas pasteur Cristalizador Frasco lavador Barras paralelas

TINCIÓN NEGATIVA • • Rápido Sin fijación Colorea el fondo Ventajas: morfología externa • Inconveniente: no se ve la motilidad • Colorante: tinta china o nigrosina al 1% • Limpiar porta • Colocar gota suspensión y gota de nigrosina • Mezclar con el asa • Secar a Tª ambiente • Observar al M.

TINCIÓN NEGATIVA (tinta china)

TINCIÓN DE GRAM • METODO TAXONÓMICO • SOLAMENTE DEBE USARSE EN CULTIVOS JÓVENES. • ALGUNAS BACTERIAS SON GRAM (+) SÓLO DURANTE LAS PRIMERAS FASES DE SU DESARROLLO.

TINCIÓN DE GRAM (BACILOS)

TINCIÓN DE GRAM

TINCIÓN ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTE

TINCIÓN ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTE • PARA Mycobacterium. • PARED MUY RICA EN LÍPIDOS QUE NO SE DECOLORA. • AAR: ROJAS: acido resistentes (Mycobacterium) • NO AAR: AZUL

TÉCNICA • EXTENDER, FIJAR, SECAR • • • FUCSINA EN CALIENTE (5 -10 m) LAVAR DECOLORAR CON ÁCIDO-ALCOHOL LAVAR AZUL DE METILENO (2 -3 m) LAVAR

TINCIÓN DE CÁPSULAS MÉTODO DE ANTHONY 1. 2. 3. 4. EXTENDER, SECAR NO FIJAR CRISTAL VIOLETA AL 1% (2 m) LAVAR CON SULFATO DE COBRE AL 20% Resultado: La capsula de tiñe de AZUL VIOLETA. El resto de AZUL OSCURO.

TINCIÓN DE CÁPSULAS CON TINTA CHINA

TINCIÓN DE ESPORAS 1. EXTENDER, FIJAR, SECAR. 2. VERDE MALAQUITA EN CALIENTE. 3. LAVAR 4. SAFRANINA O FUCSINA. 5. LAVAR. Resultado: endosporas teñidas de verde. El resto, rojo.

Se introduce el colorante dentro de la espora, haciendo que luego lo pierda el resto de la célula, y esta se tiñe con un colorante de contraste, como la safranina o fucsina

TINCIÓN DE ESPORAS

TINCIÓN DE FLAGELOS 1. MUESTRA JOVEN EN AGAR INCLINADO. SOBRE CUBRE. 2. FIFAR CON VAPOR DE A. ÓSMICO AL 1%. 3. SUSPENDER EN FORMALINA AL 0, 5%. 4. DEJAR RESBALAR SOBRE EL PORTA. 5. MORDIENTE DE RHODES. 6. LAVAR POR INMERSIÓN 7. NITRATO DE PLATA AMONIACAL AL 5%, CALENTADO A 95º

TINCIÓN DE FLAGELOS