PRCTICO N 1 Tcnicas para el estudio de

PRÁCTICO N° 1 Técnicas para el estudio de microorganismos del suelo Objetivo: Conocer las técnicas básicas para el análisis microbiológico del suelo 1) Normas prácticas para el muestreo de suelo 2) Técnicas para el cultivo de microorganismos 3) Técnicas de observación al microscopio 4) Métodos de aislamiento y conservación

Normas prácticas para el muestreo de suelo 1) Diseño de muestreo: • Cantidad de muestras: topografía y heterogeneidad del lote • Forma de muestreo: cultivo, sistema de labranza • Profundidad: 0 – 20 cm 2) Acondicionamiento de las muestras 3) Preparación de las muestras en laboratorio

Cantidad de muestras: topografía y heterogeneidad del lote Loma 15 Submuestras = 1 Muestra Medialoma Bajo Agricultura de Precisión Imagen Satelital Mapa de Rendimiento Mapa de Ambientes

Elementos de muestreo Pala Barreno Manual Barreno Hidráulico

Forma de muestreo: cultivo y sistema de labranza Siembra directa Rastrojo de maíz Rastrojo de soja Labranza convencional Suelo laboreado

Forma de muestreo: profundidad 0 cm. 20 cm.

Acondicionamiento de las submuestras ~200 g.

Preparación de las muestras en laboratorio Oreado Mínimo 24 hs. Tamizado Embolsado y Rotulado Conservación

Técnicas para el cultivo de microorganismos Requerimientos para el cultivo de microorganismos en laboratorio: 1) Condiciones de asepsia: esterilización 2) Medios de cultivos 3) Condiciones ambientales

Condiciones de asepsia: esterilización • Esterilización: eliminar todos los organismos vivos • Métodos de esterilización: – – Calor: húmedo y seco Radiación Filtración Productos químicos

Calor húmedo: Autoclave Combinación de calor, presión y humedad Para sustancias acuosas Temperatura de esterilización: 121°C - 20 minutos A gas con regulación manual Eléctrica con regulación automática

Calor seco: Horno de esterilización Vista exterior Vista interior Para materiales estables al calor (vidrio, metal, porcelana etc. ) Temperatura de esterilización: 160 °C Tiempo: 2 hs

Otros métodos de esterilización Radiación UV: superficies, aire y agua Filtración: soluciones lábiles Productos químicos: mesada, manos, tapones, etc. Filtro • Agua Oxigenada • Alcohol etílico • Hipoclorito • Formol • Bicloruro de mercurio

Medios de cultivos • Definición: mezcla balanceada de requerimientos nutritivos para el crecimiento de microorganismos • Tipos: – Generales – Selectivos • Composición química: fuente de carbono, fuente de nitrógeno, fuente de energía, base mineral y factores de crecimiento • Características: líquidos o sólidos: agentes solidificantes

Composición de medios de cultivos Medio selectivo: Fijadores de Nitrógeno FUENTE Fuente de Cy energía Base mineral Agua COMPUESTO Medio general CANTIDAD FUENTE COMPUESTO CANTIDAD Sucrosa 20 g Fuente de C y energía Almidón 12 g Fosfato di potásico 0. 05 g Fuente de N NO 3 Na 0. 5 g Fosfato monopotásico 0. 15 g PO 4 HK 2 1. 0 g Cloruro de calcio 0. 01 g SO 4 Mg 7 H 2 O 0. 5 g Sulfato de magnesio 0. 2 g Agente solidificante Agar 15 g Molibdato de sodio 0. 002 g Agua destilada 1000 ml Cloruro férrico 0. 01 g Carbonato de calcio 0. 1 g Agua destilada 1000 ml p. H = 7 Base mineral p. H = 7

Preparación de medios de cultivo Pesar componentes sólidos: encender registrar la lectura colocar recipiente para pesar tarar colocar el componente a pesar

Disolver con agua destilada: hidratar componentes sólidos agregar agua disolver

Regular p. H: p. Hmetro soluciones reguladoras encendido y lavado protección del electrodo lectura lavado del electrodo

Preparación de medio sólido medio líquido fundir al calor agregar agar medio agarizado

Fraccionar y acondicionar para esterilizar Fraccionamiento de medio líquido Fraccionamiento de medio sólido (en caliente) Acondicionado para esterilizar

Esterilizar en autoclave Medios en “Pico de flauta”

Visualización de microorganismos: porta objeto enterrado Suelo en estudio Riego Incubación Portaobjeto enterrado

Cultivo de microorganismos del suelo en medio líquido Siembra Dilución Incubación

Tamaño del lote Cantidad de muestras Muestreo de suelo Profundidad 0 -20 cm. con rastrojos Topografía Composición n° submuestras Guardar en conservadora Una muestra Preparación de muestras en laboratorio Oreado Tamizado Envasado y Rotulado Conservación en heladera

Práctico 1 Esterilización Laboratorio Medio de cultivo Práctico 2 Aislamiento Observación • Autoclave - horno • Radiación • Filtración • Productos químicos Composición química • Base mineral • Fuente de carbono • Fuente de energía • Agua Preparación de medios Líquidos Sólidos • Pesar drogas • Disolver con agua destilada • Regular p. H • Fraccionar • Pesar drogas • Disolver con agua destilada • Regular p. H • Agarizar • Fundir • Fraccionar Esterilización en autoclave Siembra de suelo Incubación

Actividades 1) Preparación de muestras de suelo en laboratorio: tamizar, embolsar y rotular. 2) Visualización de microorganismos de suelo: enterrar un portaobjeto. 3) Cultivo de microorganismos de suelo: colocar una alícuota de suelo en medios general y selectivo enterrar un portaobjeto. 4) Visita al Laboratorio de Microbiología Agrícola F. C. A