Praktikum Analisa Pangan Analisa SDSPAGE by Mochamad Nurcholis

Praktikum Analisa Pangan Analisa SDS-PAGE by Mochamad Nurcholis, STP. MP

Electrophoresis Definition : Movement of charged colloidal particles and macromolecular ions under the influence of an electric field. Electrophoresis in food analysis, generally restricted to proteins. The charge on the protein depends on the p. H of the solution.

Why Electrophoresis ? ? ? Quantiative analysis and fractination of biological fluids Characterization of purified components Detection and characterization of macromolecular interactions

Type of Electrophoresis Moving boundary electrophoresis Zone electrophoresis SDS Disk Electrophoresis Paper electrophoresis SDS-PAGE

Zone Electrophoresis Using solid supports and in gels Conventional Zone Electrophoresis Suitable for the analysis of small quantities of material (Low Molecular Weight / LMW) Fairly simple procedures Sample components are separated based on their difference net charge, size and shape The separation takes place at a constant p. H and ionic strength

SDS Disk Electrophoresis Technique used for determine the molecular weight (MW) of proteins Obtained MW of 15. 000 -70. 000 Da (Dalton) Involves addition of SAA (Surface Active Agent) such as SDS (Sodium Dodecyl Sulfonate) Visualized the gel with Coomasie Brilliant Blue R-250

SDS-Page Prinsip Analisis : Suatu metode untuk memisahkan makromolekul seperti asam nukleat dan protein berdasarkan ukuran, muatan listrik dan ciri fisik. Tujuan : Mengetahui prinsip dasar pemisahan protein dengan metode elektroforesis Menentukan berat molekul kasein

ELEKTROFORESIS SDS-PAGE Protein mempunyai muatan positif dan negatif Muatan listrik menyebabkan protein bergerak ke elektroda melewati gel poliakrilamid Gel memisahkan molekul berdasarkan : 1. Ukuran 2. Bentuk molekul 3. Kekuatan medan listrik 4. Sifat hidrofobik relatif sampel 5. Kekuatan ionik. Poliakrilamid memisahkan Protein MW 0, 5 -250 k. Da memisahkan DNA 5 -2000 bp

Isoelectric Point (p. I) Every protein has an isoelectric point (p. I) at which the net charge is zero and at which it has zero mobility. p. H values below p. I protein migrates as a cation, mobility increasing with decreasing p. H values above p. I protein migrate as an anion, mobility increasing with increasing p. H

Media for Electrophoresis Paper strip Cellulose acetate Agar Starch Polyacrylamide gels (PAGE) molecular sieving is utilized to great advantage. PAGE Size, shape and electrophoretic mobility, Improved resolution

MARKER LMW (Low Molecular Weight) 14, 4 -97 k. Da HMW-SDS (High Molecular Weight) 53 -220 k. Da HMW-Native 66 -669 k. Da Peptide marker kit (Horse myoglobin peptides) Mr = 2, 5 -17 k. Da

LMW Marker Protein Mr (k. Da) Source Amount (µg) Phosphorylase b Albumin 97 66 Rabbit muscle Bovine serum 67 83 Ovalbumin 45 147 Carbonic anhydrase Trypsin inhibitor α-lactalbumin 30 Chicken egg white Bovine erythocyte Soybean Bovine Milk 20, 1 14, 4 83 80 116

HMW-SDS Marker Protein Mr (k. Da) Source Amount (µg) Myosin α-2 -Macroglobulin 220 170 Rabbit muscle Bovine plasma 25 100 β-Galactosidase Transferrin Glutamate dehydrogenase 116 76 53 Escherchia coli Human Bovine liver 16 17 18

HMW-Native Marker Protein Mr (k. Da) Source Amount (µg) Thyroglobulin Ferritin 669 440 Porcine thyroide Equine spleen 76 50 Catalase Lactate dehydrogenase Albumin 232 140 Bovine liver Bovine heart 36 48 66 Bovine serum 40

Bahan-Bahan Sampel Kasein Buffer Bufer Tris-Cl 0, 5 M p. H 6, 8 ; SDS 2% ; Merkaptoetanol 0, 05% Larutan stock Akrilamid 30% 29. 2 gram akrilamid ditambah 0. 8 gram N’N’-bis-methylene acrylamid dalam 100 ml aquades.

Bahan-Bahan Larutan SDS 10 % Amonium persulfat (APS) 10% (di buat setiap akan digunakan) TEMED Larutan Pewarna (Staining) 0. 1 % commasie blue dalam larutan metanol : air : asam asetat (5: 5: 2) Larutan Pembilas (destaining) metanol : air : asam asetat (5: 5: 2) Aquades

Alat Seperangkat alat elektroforesis Mikropipet Tip Beker glass 100 ml Beker glas 50 ml Eppendorf Shaker

Seperangkat Alat Elektroforesis

Prosedur Kerja Pembuatan gel : Pasanglah alat gelas untuk mencetak gel ke tempat yang disediakan (seperti gambar 4. ) Untuk membuat 20 ml gel 20% campurkan 13. 3 ml larutan stok akrilamid 30%, 5 ml buffer Tris-HCl 0. 5 M, p. H 6. 8, 0. 2 ml SDS 10%, 1. 5 ml aquades. Tambahkan segera 100 µl APS 10% dan TEMED 10 µl Aduk hingga tercampur merata Tuangkan ke dalam cetakan gel dengan menggunakan mikropipet hingga tinggi yang dikehendaki. Beri sisa tempat untuk stacking gel di bawah area peletakan gigi sisir. Biarkan gel terpolimerisasi selama 15 -30 menit dalam suhu ruang.

Prosedur Kerja Tuangkan aquades dengan mikropipet ke permukaan gel pemisah dan kemudian buang aquades tersebut dengan menyerapkan tisu Sementara itu buat lagi gel untuk membuat 4 ml stacking gel 4% dengan mencampur 1. 2 ml larutan stok akrilamid 30%, 0. 5 ml buffer Tris-HCl 6. 8, 40 µl SDS 20%, 2. 26 ml aquades. Tambahkan segera 20 µl 10% APS dan 5 µl TEMED. Tuangkan larutan ke atas gel pemisah Sisipkan gigi sisir pada stacking gel dengan perlahan, jangan sampai terbentuk gelembung. Biarkan gel terpolimerisasi selama 15 -30 menit dalam suhu ruang Ambillah sisir secara perlahan dari gel. Pindahkan gel secara perlahan ke dalam tank elektroforesis (seperti gambar 5. ) Masukkan buffer tank ke dalam tank elektroforesis

Prosedur Kerja Persiapan sampel Larutkan 0. 1 gram kasein ke dalam 4. 9 gram sampel buffer Panaskan pada suhu 90 o. C selama 5 menit. Pemisahan protein dengan elektroforesis Masukkan sampel ke dalam sumuran sebanyak 5 µl Pasanglah elektrode sesuai dengan warnanya. Gel dijalankan pada tegangan 200 V selama 45 menit atau hingga sampel telah mencapai bagian dasar.

Pemisahan Molekul Berdasarkan Berat Molekul dan Muatan

Proses Elektroforesis

Pewarnaan Gel Hentikan listrik, pindahkan gel dari tank Pindahkan glass plate dari gel kedua sisi Tuangkan larutan pewarna pada gel dalam wadah Tutup dengan plastik dan letakkan di atas shaker selama 15 -30 menit Pindahkan larutan pewarna dari gel. Simpan untuk digunakan kembali. Bilas gel dengan aquades Tuangkan larutan pembilas selama dan masukkan potongan kertas saring, biarkan selama 10 -15 menit di atas shaker Ganti larutan pembilas dengan yang baru hingga yang terlihat pada gel adalah pita-pita protein.

Pengamatan Amati pita-pita yang terbentuk pada gel elektroforesis. Cari dalam literatur berat molekul masing-masing komponen penyusun kasein dan tentukan letak komponen tersebut pada pita gel elektroforesis.

Hasil SDS-PAGE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M

TERIMA KASIH cholis_federer@yahoo. co. id