POSTAVLJANJE ETIOLOKE DIJAGNOZE VIRUSNIH INFEKCIJA Institut za javno

POSTAVLJANJE ETIOLOŠKE DIJAGNOZE VIRUSNIH INFEKCIJA Institut za javno zdravlje Vojvodine Prof. dr Ivana Hrnjaković Cvjetković

1. DIREKTNO DOKAZIVANJE IZOLACIJOM I IDENTIFIKACIJOM VIRUSA • 1. 1 IZOLACIJOM VIRUSA U KULTURI ĆELIJA • 1. 2 IZOLACIJOM VIRUSA U EMBRIONISANOM KOKOŠIJEM JAJETU • 1. 3 IZOLACIJOM VIRUSA U LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA

2. DIREKTNO DOKAZIVANJE VIRUSA U BOLESNIČKOM MATERIJALU BEZ PRETHODNOG UMNOŽAVANJA • 2. 1 METODE ZA DOKAZIVANJE VIRUSA • ELEKTRONSKA I IMUNOELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA 2. 2 TEHNIKE ZA DIREKTNO DOKAZIVANJE VIRUSNIH ANTIGENA U UZORCIMA BOLESNIČKOG MATERIJALA TESTOVI FLUORESCENTNE MIKROSKOPIJE (direktni, indirektni i antikomplementarni) ENZIMSKE IMUNOMETODE (direktna sendvič elisa metoda, inhibiciona i kompetitivna) RADIOIMUNE METODE

2. DIREKTNO DOKAZIVANJE VIRUSA U BOLESNIČKOM MATERIJALU BEZ PRETHODNOG UMNOŽAVANJA • 2. 3 METODE ZA BRZU I SPECIFIČNU IDENTIFIKACIJU SASTOJAKA VIRUSA U BOLESNIČKOM MATERIJALU Lančana reakcija polimerizacije nuklenskih kiselina (PCR) Tehnike hibridizacije nukleinskih kiselina Elektroforeza ribonukleinske kiseline virusa u poliakrilamid gelu

3. INDIREKTNO DOKAZIVANJE SEROLOŠKE REAKCIJE ZA DOKAZIVANJE SPECIFIČNIH ANTITELA U SERUMIMA • 3. 1 SEROLOŠKE REAKCIJE ETIOLOŠKOG SPECIFITETA Reakcija vezivanja komplementa (RVK) Neutralizacioni test Inhibicija hemaglutinacije Aglutinacija Precipitacija ELISA Testovi fluorescentne mikroskopije Radioimunoesej

3. SEROLOŠKE REAKCIJE ZA DOKAZIVANJE SPECIFIČNIH ANTITELA U SERUMIMA • 3. 2 SEROLOŠKE REAKCIJE SLUČAJNOG SPECIFITETA PAUL –BUNELL- DAVIDSOHN-ova PROBA

Dokazivanje virusne infekcije • 1. početak infekcije • 2. -4 dokazivanje virusa • • , virusnih antigena ili virusne nukleinske kiseline 5. dokazivanje antivirusnih antitela klase Ig. M i 6. dokazivanje antivirusnih antitela klase Ig. G

IZOLACIJA VIRUSA NA KULTURI ĆELIJA

ZNACI RAZMNOŽAVANJA VIRUSA U ĆELIJAMA KULTURE • U RANOJ FAZI RAZMNOŽAVANJA MOGU SE DOKAZATI I VIRUSNI ANTIGENI

ZNACI RAZMNOŽAVANJA VIRUSA U ĆELIJAMA KULTURE • CITOPATOGENI EFEKAT (cpe) SVE • MORFOLOŠKE PROMENE KOJE VIRUS IZAZIVA RAZMNOŽAVAJUĆI SE U KULTURI ĆELIJA PROMENE JEDRA, GRANULACIJE U CITOPLAZMI, ZAOKRUGLJIVANJE ĆELIJE, SPAJANJE ĆELIJA I STVARANJE SINCICIJUMA ĆELIJE KULTURE PROPADAJU ZBOG CITOCIDNOG EFEKTA VIRUSA TAKO NASTAJU DEFEKTI PROZORI U KULTURI ĆELIJA

CITOPATOGENI EFEKAT • CMV u fibroblastnim ćelija , sporo raste, fokusi su mali i diskretni. “sovinog oka” su karakteristične inkluzije u jedru inficiranih ćelija

CITOPATOGENI EFEKAT • VZV nukleusi inficiranih ćelija su uvećani i pokazuju eozinofilne intranuklearne inkluzije. Zaokruživanj e ćelija i izraziti afinitet za eozin u kasnoj fazi infekcije

ZNACI RAZMNOŽAVANJA VIRUSA U ĆELIJAMA KULTURE • ZBOG RAZMNOŽAVANJA VIRUSA U ĆELIJAMA USPORAVA METABOLIZAM ĆELIJE I SMANJENA JE POJAVA KISELE REAKCIJE ŠTO JE DOKAZ DA SE VIRUS RAZMNOŽAVA U ĆELIJI IAKO NE DAJE VIDLJIV CPE • POJAVA V IRUSNE HEMAGLUTINACIJE I HEMADSORBCIJE

ZNACI RAZMNOŽAVANJA VIRUSA U ĆELIJAMA KULTURE • PRISUSTVO VIRUSA KOJI NE DAJE VIDLJIV CPE MOŽE SE DOKAZATI I INTERFERENCIJOM VIRUS RUBELE NA VERO KULTURI NE DAJE CPE I NJEGOVO SE UMNOŽAVANJE MOŽE DOKAZATI INTERFERENCIJOM SA ECHO VIRUSOM 11. Ukoliko se virus rubele razmnožava na vero ćelijama inokulisan echo 11 neće moći da se umnoži i da cpe zbog interferencije sa virusom rubele

ZNACI RAZMNOŽAVANJA VIRUSA U ĆELIJAMA KULTURE • U RANOJ FAZI RAZMNOŽAVANJA MOGU SE DOKAZATI I VIRUSNI ANTIGENI

ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA • RANA I BRZA • • DIJAGNOSTIKA VIRUS SE VIDI BEZ PRETHODNOG UMNOŽAVANJA NIJE MOGUĆA IDENTIFIKACIJA VIRUSA SKUPA OPREMA I OBUČEN KADAR ZA VIRUSE KOJI SE NE MOGU UMNOŽAVATI U LABORATORIJI

ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA • UMESTO SVETLOSNIH ZRAKA SNOP ELEKTRONA KOJI SE PROSTIRU U VAKUMU • UMESTO OPTIČKIH SOČIVA ELEKTROMAGNETNA POLJA • SLIKA SE EMITUJE NA EKRAN ILI SE FOTOGRAFIŠE • UVEĆANJE JE 100 000 PUTA

ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA • PREPARATI SE PRAVE KAO ULTRATANKI REZOVI • TANJI OD 100 nm U CILJU POVEĆANJA KONTRASTA U PREPARAT SE PRSKA POD MALIM UGLOM SUSPENZIJOM KOLOIDNOG ZLATA ČIME SE POSTIŽE PLASTIČAN IZGLED VIRUSA KOJI SU SA JEDNE STRANE OSVETLJENI A SA DRUGE U SENCI POZITIVNO PRIKAZIVANJE

ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA • OSIM POZITIVNOG PRIKAZIVANJE MOŽE SE VRŠITI I NEGATIVNO PRIKAZIVANJE TRETIRANJEM PREPARATA KALIJUM FOSFOTUNGSTATOM KOJI JE NEPROBOJAN ZA SNOP ELEKTRONA

IMUNOELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA • UZORAK SE PRETHODNO MEŠA SA POZNATIM • • ANTIVIRUSNIM ANTITELIMA (OBIČNO MONOKLONSKIM) ZATIM SE ELEKTRONSKIM MIKROSKOPOM TRAŽI IMUNOLOŠKA REAKCIJA IZMEĐU DODATIH ANTITELA I VIRUSA NA OVAJ NAČIN SE POSTIŽE DOKAZIVANJE VIRUSA I NJEGOVA IDENTIFIKACIJA što se ne postiže elektronskim mikroskopom

DOKAZIVANJE VIRUSNIH ANTIGENA • DIREKTNA , INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENTNA i ANTIKOMPLEMENTARNA TEHNIKA kvalitetan uzorak, poliklonalna ili monoklonalna antitela obeležena fluorofromom i fluorescentni mikroskop • ENZIMSKI IMUNOESEJ ELISA poliklonalna • ili monoklonalna antitela obeležena enzimom i ELISA procesor RADIOIMUNOESEJ poliklonalna ili monoklonalna antitela obeležena

DOKAZIVANJE VIRUSNOG GENOMA • HIBRIDIZACIJA NOVA, SPESIFIČNA I OSETLJIVA • • METODA ZNAČAJNA ZA DOKAZIVANJE VIRUSA KOJI SE NE MOGU KULTIVISATI PRINCIP HIBRIDIZACIJE VIRUSNA DNK EKSTRAHOVANA IZ BOLESNIČKOG UZORKA DOKAZUJE SE POMOĆU PROBE KOMPLEMENTARNOG KRATKOG LANCA NUKLEOTIDA OBELEŽENOG RADIOAKTIVNIM IZOTOPOM ILI ENZIMOM

DOKAZIVANJE VIRUSNOG GENOMA • HIBRIDIZACIJA NOVA, SPESIFIČNA I OSETLJIVA • • METODA ZNAČAJNA ZA DOKAZIVANJE VIRUSA KOJI SE NE MOGU KULTIVISATI PRINCIP HIBRIDIZACIJE VIRUSNA DNK EKSTRAHOVANA IZ BOLESNIČKOG UZORKA DOKAZUJE SE POMOĆU PROBE KOMPLEMENTARNOG KRATKOG LANCA NUKLEOTIDA OBELEŽENOG RADIOAKTIVNIM IZOTOPOM ILI ENZIMOM

BLOT HIBRIDIZACIJA • Za dokazivanje virusne DNK koristi se blot hibridizacija • Nakon EKSTRAKCIJE DNK iz uzorka vrši se DENATURACIJA kuvanjem čime se dobijaju fragmenti jednostruke nukleinske kiseline dugi nekoliko stotina nukleotida koji se vezuju za čvrstu podlogu nitroceloloznu ili najlonsku membranu U fazi HLAĐENJA vrši se ANELACIJA vezivanje jednolančanih nukl. kiselina za oboležene probe čime se formiraju hibridi

hibridizacija in situ ZA IN SITU HIBRIDIZACIJU intracelularna DNK se fiksira za predmetno staklo u tankim histopatološkim rezovima tkiva Pozitivan rezultat se očitava u vidu tačke, kruga ili dugmeta

POLIMERIZACIJA NUKLEINSKIH KISELINA PCR • PREDNOSTI • OSETLJIVOST (virus se • • • KARY Mullis, 1984/85 otkriva u koncentraciji 10 čestica po 1 ml) SPECIFIČNOST BRZINA NEDOSTACI visoka cena i mogućnost kontaminacije

POLIMERIZACIJA NUKLEINSKIH KISELINA PCR 1. DENATURACIJA na temperaturi 94 stepeni C razdvajanje lanaca DNK I dobijanje dva jednostruka lanca 2. ANELACIJA SPARIVANJE specifične genetske probe (sintetski dobijeni jednostruki lanci DNK od 20 -30 nukleotida) vezuju se za sebi komplementaran deo originalnog lanca DNK

POLIMERIZACIJA NUKLEINSKIH KISELINA PCR 3. EKSTENZIJA PRODUŽAVANJE LANACA DNK dva kratka dvostruka lanca DNK služe kao inicijalna mesta za dejstvo enzima Taq polimeraze uz čiju pomoć se od 3* kraja probe komplementarno vezuju nukleotidi Ova faza se odigrava na 72 stepena C TRI FAZE U CIKLUSU NAIZMENIČNO SE PONAVLJAJU I BROJ DVOSTRUKIH LANACA SE UDVOSTRUČAVA

SAVREMENI SEROLOŠKI TESTOVI • 1. IMUNOTESTENZIMSKI TEST ELISA • 2. IMUNOFLUORESCENTNI TEST • 3. RADIOIMUNOESEJ • KARAKTERISTIKE • VISOKA OSETLJIVOST I SPECIFIČNOST • DOKAZIVANJE KLASA IMUNOGLOBULINA • ZA DIJAGNOZU JE ČESTO DOVOLJAN JEDAN UZORAK SERUMA TE TESTOVI ZA Ig. M SPADAJU U TESTOVE ZA BRZU I RANU DIJAGNOSTIKU

INTERPRETACIJA SEROLOŠKIH REZULTATA Ig. M i Ig. G negativni nema infekcije, inkubacija ili prodromalni stadijum Ig. M pozitivna Ig. G negativna Ig. M i Ig. G pozitivna početak infekcije Ig. M negativna Ig. G visoko pozitivna Ig. M negativna uz nisko pozitivne Ig. G kasna rekonvalescencija ranije preležana bolest odmakla infekcija

Interpretacija rezultata klasičnih seroloških testova ZA DOKAZIVANJE AKUTNE VIRUSE INFEKCIJE POTREBNA SU DVA UZORKA SERUMA PRVI UZORAK NA POČETKU BOLESTI DRUGI UZORAK POSLE DVE NEDELJE OD PRVOG UZORKA

Interpretacija rezultata klasičnih seroloških testova INFEKCIJA JE AKUTNA AKO SE DOKAŽE ČETVOROSTRUKI ILI VEĆI PORAST ILI PAD TITRA U DRUGOM UZORKU ILI SEROKONVERZIJA: PRVI UZORAK JE NEGATIVAN A DRUGI POZITIVAN