Polymerase Chain Reaction PCR 1 cycle PCR cycle

Polymerase Chain Reaction (PCR) 1 cycle PCR cycle 수를 n회라 가정했을 때 표적배열은 2^n 이다. Ex) 2 times(1 cycle), 4 times(2 cycles), 8 times(3 cycles), 16 times(4 cycles), ,

RT(Reverse transcription) - PCR m. RNA를 기질로 상보적으로 역전사 효소(Reverse transcriptase)를 이용해 c. DNA(complimentary DNA)를 합성하 는 과정. 이러한 과정에서는 RNA와 primer의 annealing 위치에 따라 random hexamer, oligo d(T), 또는 증폭하고자 하는 유전자의 anti-sense primer 등이 이용된다. 1) Random hexamer : m. RNA의 모든 영역에서 c. DNA 합성을 개시 2) Oligo d(T) : m. RNA의 poly A tail에 annealing 되어, c. DNA 합성을 개시 3) Anti-sense primer : 특정 m. RNA 부위의 c. DNA 만을 합성

SYBR Green vs. Taq. Man SYBR Green 1) SYBR green (Interchelating 법) : SYBR green은 Double strand DNA에 결합하여 형 광을 나타내는 시약(Interchelator)이다. Interchelator는 PCR 반응으로 합성된 double strand DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산 물의 생성량을 측정할 수 있다. 2) Taq. Man probe법 : 5’ 말단은 형광물질(FAM 등)로 3’ 말단은 quencher 물질 (TAMRA 등)로 수식한 oligonucleotide(Taq. Man probe)를 PCR 반응에 첨가하는 방 법이다. Taq. Man probe는 annealing step에서 template DNA에 특이적으로 hybridize 하지만, probe 상에 quencher에 의해 형광 발색이 억제된다. Extension 반응시에 Taq DNA polymerase가 갖는 5’ -> 3’ exonuclease 활성으로 template에 hybridize한 Taq. Man probe가 분해되어 형광색소가 probe에서 유리되면서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 나타낸다. Taq. Man

Protocol 1. 4 ul of 5 ng/ul c. DNA (Total 20 ng)을 96 well plate에 넣어준다. (색깔에 맞추어서 가로로 4 ul씩 넣어주기) 2. Forward primer, Reverse primer 그리고 SYBR Green을 다음과 같은 비율로 섞어준다. Reagent volume X 5 Forward primer 0. 2 ul 1 ul Reverse primer 0. 2 ul 1 ul 2 x SYBR Green 10 ul 50 ul DW 5. 6 ul 28 ul Total 16 ul 80 ul

Protocol 3. 2번의 mixture를 해당하는 부분에 16 ul씩 96 well 에 넣어준다. 4. Cover를 붙여주고, 1000 rpm으로 5분간 centrifuge. 5. PCR을 시행한다. (약 2시간 소요) Steps Condition Denaturation 95℃, 15 sec Annealing 60℃, 15 sec Extension 72℃, 45 sec Cycle 40 cycle

Result 결과 예시 > Ct 값 Target gene (Gene X) Reference Gene (β-actin) Control (대조군) 24 19 WY 14643 (실험군) 22 20 Gene X 9 Ct 값 d. Ct (Target – Ref) Control (대조군) 24 – 19 = 5 WY 14643 (실험군) 22 – 20 = 2 Ct 값 dd. Ct Control (대조군) 5– 5=0 WY 14643 (실험군) 2 – 5 = -3 상대비율 2^ (-dd. Ct ) Control (대조군) 2^(-0) = 1 WY 14643 (실험군) 2^(3) = 8 Relative m. RNA level 8 7 6 5 4 3 2 1 0 A B

Discussion Q. 이제까지의 결과들을 조합해볼 때, WY 14643의 효능에 대해 기술하시오. > Key word : fatty liver, WY 14643, mitochondrial b-oxidation, cpt 1, ppar alpha, protein expression, luciferase expression, m. RNA expression