Polyklonov a monoklonov protiltky Polyklonov konvenn a monoklonov

Polyklonové a monoklonové protilátky Polyklonové (konvenčné) a monoklonové protilátky. Lymfocytové hybridómy. Príprava monoklonových protilátok. Vlastnosti a význam monoklonových protilátok. Imunotoxíny. Možnosti génového inžinierstva protilátok. Chimérové, humanizované, heterobišpecifické, jednoreťazcové a katalytické protilátky. Izolácia a príprava čistých Ig. Terapeutické preparáty Ig. Základy imunologickej tolerancie a vznik tolerancie na vlastné antigény

Polyklonové protilátky HETEROGÉNNA POPULÁCIA BUNIEK • produkty niekoľkých klonov B-lymfocytov • zmes niekoľkých typov molekúl s rôznou afinitou a špecifickosťou väzobného miesta Vznik IMUNIZÁCIA jedinca imunogénom (náhodná, cielená, experimentálna)

Monoklonové protilátky HOMOGÉNNA POPULÁCIA BUNIEK • produkty 1 klonu plazmatických buniek odvodených od B-lymfocytov • identické kópie Ig s rovnakou primárnou štruktúrou a špecifickosťou VM a rovnakými výkonnými funkciami Vznik SPONTÁNNE pri nádorovom raste plazmatických buniek (gamapatiach) • VIACNÁSOBNÝ MYELÓM – Ig. G, Ig. A, Ig. D, Ig. E • BENCE-JONESOVE PROTEÍNY – diméry L-reťazcov (λ alebo κ) • WALDENSTRÖMOVA MAKROGLOBULINÉMIA – Ig. M • CHOROBA ŤAŽKÝCH REŤAZCOV- nekompletné reťazce γ, α, μ UMELO pomocou lymfocytových hybridómov v lab. podmienkach • HYBRIDÓMOVÁ TECHNOLÓGIA - Köhler a Milstein 1975 (Nobelova cena 1984) • FÚZIA: B-LYMFOCYT + MYELÓMOVÁ BUNKA = HYBRIDNÁ BUNKA • = HYBRID-MYELÓM = HYBRIDÓM

Pricíp vzniku protilátok

Hybridómová technológia

Hybridómová technológia

Fúzia buniek FÚZIA BUNIEK • ŽIADNA (nefúzované bunky) • HYBRIDNÉ BUNKY (B-lymfocyt + myelómová bunka) • DVE ROVNAKÉ BUNKY (lymfocyt-lymfocyt, myelómová bunka-myelómová bunka) fúzogény – látky, ktoré urýchľujú spojenie buniek • inaktivovaný vírus Sendai • iné vírusy • polyetylénglykol (Mr = 2000 – 6000) Výsledok • získanie buniek, ktoré majú trvalý rast in vitro a in vivo • nesmú produkovať myelómové protilátky • diferencované tak, aby produkovali protilátky aj po fúzii

Selekcia hybridných buniek METÓDA založená na ENZÝMOVÝCH DEFEKTOCH • v bunkách in vitro možno navodiť enzýmové defekty (myelómové bunky) • bunky s enzýmovými defektami nerastú v selekčných médiách • hybridné bunky môžu neprítomnosť enzýmu v jednej bunke kompenzovať stratu jeho prítomnosťou v partnerskej bunke Defekty v syntéze nukleotidov hlavná (de novo pathway) – z aminokyselín, sacharidov blokuje ho aminopterín vedľajšia (salvage pathway) – z purínových báz a nukleozidov HGPRT (hypoxantín guanín fosforibozyltransferáza) - mutanty sa získajú kultiváciou s 8 -azaguanínom TK (tymidínkináza) - mutanty sa získajú kultiváciou s 5 brómdeoxyuridínom

Selekcia hybridných buniek Hypoxantín IMP PP PRPP tymidín TMP ATP ADP

Selekcia hybridných buniek Selekčné médium HAT • H – hypoxantín • A – aminopterín • T – tymidín prídavok inzulínu do HAT média zvýši tvorbu hybridómov nefúzované a fúzované lymfocyty – hynú po 7 -10 dňoch nefúzované a fúzované myelómy – neprežijú v HAT médiu hybridné bunky – prežívajú v HAT médiu dlhodobo

Vlastnosti monoklonových protilátok • • CHEMICKÉ INDIVÍDUÁ MONOŠPECIFICKÉ (len proti jednému epitopu) ÚČINNÉ V NIŽŠÍCH KONCENTRÁCIÁCH PRÍPRAVA V NEOBMEDZENÝCH MNOŽSTVÁCH (aj proti neprečisteným antigénom) • NEPRECIPITUJÚCE PROTILÁTKY

Využitie monoklonových protilátok ANALYTICKÉ A IZOLAČNÉ IMUNOCHEMICKÉ METÓDY • izolácie enzýmov, proteohormónov, cytokínov a iných diagnosticky dôležitých látok • riešenie problémov biochémie a molekulovej biológie MAPOVANIE EPITOPOV • výskum štruktúry zložitých biopolymérov a subcelulárnych štruktúr MAPOVANIE POVRCHOVÝCH ZNAKOV (ANTIGÉNOV) BUNIEK • kvantifikácia jednotlivých bunkových populácií a subpopulácií • určenie diferenciačných štádií buniek DIAGNOSTIKA INFEKČNÝCH CHORÔB • určenie patogénu (vírus, baktéria, parazit), ktorý vyvolal ochorenie

Využitie monoklonových protilátok DIAGNOSTIKA A EXPERIMENTÁLNA LIEČBA NÁDOROV • lokalizácia nádorov v organizme rádioimunoscintigrafiou • príprava imunotoxínov na cielenú liečbu nádorov • karcinoembryový antigén (CEA), α-fetoproteín (AFP), β 2 mikroglobulín, choriónový gonadotropín, feritín, kyslá prostatová fosfatáza • IMUNOTOXÍNY – konjugáty s toxínmi – Toxíny: ricín, abrín, difterický toxín, Shigella toxín – Cytostatiká: adriamycín, daunomycín, metotrexát – Rádionuklidy EXPERIMENTÁLNA LIEČBA AUTOIMUNITNÝCH CHORÔB • antiidiotypové monoklonové protilátky proti autoprotilátkam • choroby: myasthenia gravis, Gravesova choroba, diabetes mellitus a iné

Génové inžinierstvo protilátok

Génové inžinierstvo protilátok CHIMÉROVÉ MONOKLONOVÉ PROTILÁTKY • prvá generácia humanizovaných protilátok • obsahujú myšacie variabilné domény (modré) a ľudské konštantné domény (šedé) ZLOŽENÉ PROTILÁTKY • druhá generácia humanizovaných protilátok • chimérové monoklonové protilátky obsahujúce hypervariabilné úseky CDR myšacieho pôvodu (modré) vsunuté do ľudských FR-oblastí (šedé) HYBRIDNÉ PROTILÁTKY • chimérové monoklonové protilátky, v ktorých je koncová Fc doména nahradená toxínom (biele) • okrem väzby antigénu (VM) majú aj iné aktivity (katalytické, imunodiagnostické, imunoterapeutické, imunotoxické) HETEROBIŠPECIFICKÉ PROTILÁTKY • hybridné protilátky, ktoré majú dve rôzne väzbové miesta s odlišnými špecifickosťami: napr. jedno pre antigén spojený s nádormi, druhé pre TCR

Príprava heterobišpecifických protilátok • fúzia dvoch hybridómov QUADRÓMOVÁ TECHNOLÓGIA • fúzia hybridómu a buniek sleziny TRIÓMOVÁ TECHNOLÓGIA • fúzia dvoch variabilných génov GÉNOVÉ INŽINIERSTVO

Metódy génového inžinierstva VYUŽITIE • IMUNOKOMPATIBILNÉ – CHIMÉROVÉ PROTILÁTKY • ZLOŽENÉ PROTILÁTKY • ZMENA BIOLOGICKÉHO POLČASU PROTILÁTKY • PREPNUTIE PRODUKCIE NA INÝ IZOTYP (napr. z Ig. M na Ig. G) • ZVÝŠENIE AFINITY ALEBO AVIDITY • ZMENA EFEKTOROVÝCH FUNKCIÍ (napr. väzba na Fcreceptory) • HYBRIDNÉ PROTILÁTKY – fúzia Ig génov s inými génmi • HETEROBIŠPECIFICKÉ PROTILÁTKY - fúzia dvoch rôznych V-génov

Metódy génového inžinierstva NEVÝHODY použitia monoklonových protilátok hlodavcov u ľudí • KRÁTKY POLČAS EXISTENCIE v krvnom sére • NENAHRÁDZAJÚ EFEKTOROVÉ FUNKCIE ľudských Ig (len niektoré triedy myšacích Ig) • VYVOLANIE NEŽIADÚCEJ IMUNITNEJ ODPOVEDE u pacientov (izotypovo odlišné protilátky) • VZNIK ĽUDSKÝCH ANTI-MYŠACÍCH PROTILÁTOK (HAMA – human anti-mouse antibodies) – zvyšujú katabolizmus aplikovaných protilátok – blokujú ich terapeutický účinok – vyvolávajú alergické reakcie (anafylaxia, tvorba imunokomplexov)

Metódy génového inžinierstva HUMANIZÁCIA monoklonových protilátok hlodavcov • CHIMÉROVÉ (1. generácia) • ZLOŽENÉ (2. generácia) = CDR-štepové protilátky • HYBRIDNÉ (3. generácia) ĽUDSKÉ MONOKLONOVÉ PROTILÁTKY • IMUNIZÁCIA ĽUDSKÝCH LYMFOCYTOV in vitro • SCID MYŠI s ťažkou kombinovanou imunodeficienciou (severe combined immunodeficiency) – takmer úplne chýba bunková a humorálna imunita • MOŽNOSŤ KLONOVANIA VEĽKÝCH FRAGMENTOV DNA v umelých kvasinkových chromozómoch

Jednoreťazcové protilátky • vznikajú kovalentnou väzbou fragmentu Fv (VL a VH) s rozličnými efektorovými molekulami (enzýmy, hormóny, liečivá)

Katalytické protilátky • katalytické protilátky majú Fc domény alebo ich časť nahradenú kovalenne nadviazaným enzýmom • abzýmy majú katalytické miesto zhodné s väzbovým miestom a špecificky viažu nízkomolekulovú látku (haptén) • účinné katalyzátory reakcií organických látok (hydrolýza esterov, amidov a karbonátov, stereošpecifické Claisenove reakcie, transacylačné reakcie)

Metódy izolácie protilátok NEŠPECIFICKÉ • FRAKCIONOVANÁ PRECIPITÁCIA – – – neutrálne soli (síran amónny – Ig. G 33%, síran sodný – Ig. G 18%) organické rozpúšťadlá (etanol – Cohnova frakcionácia, acetón) ióny kovov (Zn 2+) organické katióny (rivanol, kyselina kaprylová) polyméry (PEG 6000 – Ig. M 7%, Ig. G a Ig. A 14%)

Metódy izolácie protilátok • ELEKTROFORÉZA – rozdelenie podľa veľkosti náboja – vo voľnom roztoku (kyveta) – na nosiči (papier, agar, polyakrylamid) + dodecylsíran sodný (SDS) • IZOELEKTRICKÁ FOKUSÁCIA – rozdelenie podľa izoelektrických bodov (p. H amfolytu, kedy počet katiónov = počtu aniónov) • IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIA – ANEX = matrica (+) + anióny (-) – KATEX = matrica (-) + katióny (+) • GÉLOVÁ FILTRAČNÁ CHROMATOGRAFIA – pri styku s kvapalinou napučia za tvorby gélu (veľkosť pórov) • HYDROFÓBNA CHROMATOGRAFIA – (Ig. A Octyl- a Fenyl-Sepharose) • CHROMATOFOKUSÁCIA

Metódy izolácie protilátok ŠPECIFICKÉ • IMUNOAFINITNÁ CHROMATOGRAFIA imobilizácia ligandu na nerozpustný nosič (imunoadsorbent) – ligand (Ag, Ig, proteín A) – nosič (gély - agaróza, polyakrylamid, polymetakrylát, dextrán), – elučný roztok (kyseliny, vysoká koncentrácia ligandu)

Terapeutické preparáty TRI GENERÁCIE PREPARÁTOV • IMÚNNY SÉROVÝ GAMAGLOBULÍN – E. F. COHN (1945) – 16% roztok (70 -80% m. Ig. G), intramuskulárna aplikácia – NORGA (IMUNA) • NORMÁLNY ĽUDSKÝ IMUNOGLOBULÍN – enzýmovo degradovaný – odstránenie Fc-domén pepsínom, plazmínom – chemicky modifikovaný - β-propiolaktón - hydrolýza -S-S- redukciou a alkyláciou – 3 -5% roztok (min. 95% m. Ig. G), intravenózna aplikácia – IVEGA (IMUNA), SANDOGLOBULÍN (NOVARTIS), GAMIMMUNE (CUTTER), VEINOGLOBULINE, GAMMA-VENIN • NORMÁLNY ĽUDSKÝ IMUNOGLOBULÍN s nezmenenou štruktúrou – nezapríčiňuje anafylaktoidné reakcie (uvoľnenie histamínu a iných mediátorov anafylaxie zo žírnych buniek a bazofilov)

Použitie preparátov PROFYLAXIA (ochrana pred niektorými chorobami) • tetanový toxín, diftériový toxín, vírus vyvolávajúci hepatitídu B, besnota SUBSTITUČNÁ (NÁHRADNÁ) LIEČBA • primárne imunodeficiencie: agamaglobulinémia viazaná na chromozóm X, bežná variabilná imunodeficiencia, selektívna deficiencia Ig. G, ťažká kombinovaná imunodeficiencia - SCID • sekundárne imunodeficiencie: príjemcovia transplantátov, pediatrický AIDS, chronická lymfocytová leukémia, rizikoví novorodenci • iné choroby: Kawasakiho choroba, hemofília, idiopatická trombocyto-péniová purpura LIEČBA niektorých infekcií

Imunologická tolerancia • stav špecifickej neodpovedavosti na určitý antigén, ktorý by normálne vyvolal odpoveď • reaktívnosť klonu lymfocytov je znížená, potlačená alebo je klon eliminovaný • jedinec je schopný odpovedať na iné antigény • prirodzená (autotolerancia) alebo sekundárna (na cudzie antigény) Dôkazy • erytrocyty dvojvaječných dvojčiat dobytka sa znášajú kvôli spoločnej placente • po imunizácii novonarodenej myši slezinovými lymfocytmi inej myši bola v dospelosti schopná prijať štep kože

Tolerancia T lymfocytov Centrálna tolerancia • klonová delécia - priama delécia tých klonov lymfocytov, ktoré majú schopnosť rozpoznať a reagovať na vlastné autoantigény Periférna tolerancia • klonová anergia - nedostatok kostimulácie po rozpoznaní antigénu na MHC – ak druhý signál chýba (B 80–CD 28), bunka spácha „samovraždu“ apoptózou – ak druhý signál je neznámy, bunka sa zmení na regulačnú/supresorovú bunku • znemožnenie stretnutia sa s autoantigénom (vnútro oka, semenníky, mozog) • prijatie smrtiaceho signálu cez Fas. L – bunky vnútra oka v prípade preniknutia T-lymfocytov – makrofágy infikované HIV • kontrola regulačnými/supresorovými T-lymfocytmi • rozdiel v cirkulácii naivných a pamäťových T-lymfocytov

Tolerancia B lymfocytov Centrálna tolerancia • receptor editing - ďalšia rekombinácia ľahkých reťazcov • klonová delécia - priama delécia tých klonov lymfocytov, ktoré majú schopnosť rozpoznať a reagovať na vlastné autoantigény Periférna tolerancia • neprítomnosť signálu z TH lymfocytov udržiava autoreaktívne B lymfocyty pod kontrolou Tolerancia T lymfocytov je najdôležitejší mechanizmus udržiavania tolerancie B lymfocytov

Vývoj T-lymfocytov a súvis s toleranciou

Pozitívna a negatívna selekcia