PODMNKY PSTOVN KULTUR IN VITRO Potebn ltky kter

PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO Ø Potřebné látky, které je celistvá rostlina schopna syntetizovat v dostatečném množství a transportovat na místo určení, mohou být explantátem syntetizovány v nedostatečné míře nebo vůbec (je třeba dodat - heterotrofie). Ø Stresové situace, se kterými se celistvá rostlina vypořádá, není často explantát schopen řešit a zvládnout. Ø Nutnost indukce organogenních změn vyžaduje zabezpečení indukčních podmínek jak fyzikálních, tak chemických. Teplota Světlo Vlhkost Složení plynné fáze Složení médií Aseptická kultivace Ošetření mateřských rostlin Typ explantátu

Příprava a komponenty kultivačních médií

komponenty kultivačních médií minerální soli • makroelementy (nad 0, 5 mmol/l) • mikroelementy zdroj uhlíku a energie vitaminy růstové regulátory zdroje org. dusíku (aminokyseliny apod. ) další organické doplňky

Makroelementy: N (25 -60 m. M) - NH (2 -20 m. M) (nitrátreduktáza), 4 - NO 3(25 -40 m. M) (ne samotný p. H) bílkoviny, aminokyseliny P (1 -3 m. M) - H 2 PO 3, - HPO 3, (- PO 3) energetický metabolismus - ATP; DNA, RNA; fosfolipidy K (20 -30 m. M) - osmotická regulace, p. H a iontová rovnováha

Makroelementy: S (1 -3 m. M) - obranné reakce (glutathion, flavonoidy) Ca (1 -3 m. M) - transport, signály, membrána, iontová rovnováha, zakořenění, buněčné dělení Mg (1 -3 m. M) - enzymy, syntéza DNA, fotosyntéza

Mikroelementy: Fe (0, 1 m. M)- (Fe. Na. EDTA - etylendiaminotetraoctová kys. ) do p. H 8 přenašeče el. , proteiny - nitrátreduktáza, biosyntéza chlorofylu, Zn (5 -30 M) - enz. např alkohol dehydrogenáza v meristémech, účast při syntéze proteinů Mn (20 -90 M)- metaloproteiny, Hillova reakce (rozklad vody při fotosyntéze) Mo (1 M)- kofaktor v nitrátreduktáze Cu (0, 1 M)- redoxní reakce, fotosyntéza B (25 -100 M) stabilita membrán

• Zdroje C (sacharidy) 2 -5% • • sacharoza glukoza fruktoza (*termolabilní) laktoza maltoza (*) škrob inositol (do 0, 5%) (polyetylenglykol, manitol, sorbitol apod. )

Vitamíny (*) • hlavně skupiny B (0, 1 -10 mg/l) (kvasniční extrakt): B 1(thiamin), k. nikotinová, B 6 pyridoxin • k. pantothenová • biotin, cholin chlorid • k. listová, k. p-aminobenzoová • riboflavin • k. askorbová jako antioxidant • (myo-inositol (50 -5000 mg/l))

Růstové regulátory auxiny • IAA * • NAA(2 x), IBA(2 x), 2, 4 -D (8 -12 x), Picloram (2 -4 x)(4 -amino, 3, 5, 6 -trichloropikolinová kys. ) (2, 4, 5 -T(4 x), p. CPA)

Působení auxinů in vitro • • indukce kalusu a jeho růst podporuje dělení buněk konc (v poměru k CK) kořeny konc (v poměru k CK) prýty konc - indukce somatické embryogeneze inhibice axilár (apikální dominance) indukce kořenů x inhibice prodl. růstu kořenů

cytokininy • 2 i. P *, zeatin* • BAP (6 -benzylaminopurin) (*) • kinetin (furfurylaminopurin) * • adenin * • TDZ thidiazuron *

Působení cytokininů in vitro • • • konc prýty dělení buněk (SE indukce somatické embryogeneze) indukce kalusu a jeho růst stimulace růstu axilárních pupenů inhibice tvorby kořenů inhibice prodlužování prýtů oddálení stárnutí listů konc - riziko hyperhydricity (vitrifikace)

Vitrifikace hyperhydricita • Příčiny vitrifikace Ø vysoká relativní vlhkost Ø etylén Ø cytokininy Ø ? ? NH 4+ Fyziologický stav: Nutnost snížit R. H. , zvýšit výměnu vzduchu, snížit obsah cytokininů

Vitrifikace hyperhydricita Fyziologický stav: q q q q q ztluštělé stonky i listy, světle zelené, křehké s abnormálním sklovitým vzhledem nadměrný příjem vody narušené stomatální uzavírání změny ve složení epikutikulárních vosků defektní kutikula redukovaná vodivá pletiva velké mezibuněčné prostory v houbovém parenchymu disbalance mezi buněčným dělením a diferenciací (lignin, celulóza) změny ve stavbě buněčných stěn velké vakuoly

gibereliny GA 3 GA 7 * Působení in vitro • prodlužování prýtů • vymanění z dormance: semen, SE, apikálních pupenů, hlíz • inhibice tvorby adventivních kořenů

k. abscisová ABA* působení in vitro • • maturace SE usnadnění aklimatizace formování hlíz a cibulí vstup do dormance

Další látky s růstově regulační povahou Polyaminy (spermin, spermidin a putrescin)* • indukce adventivních kořenů • indukce prýtů • podpora SE Jasmonová kyselina * • podpora tvorby hlíz • podpoření formování meristému Fenolické látky- k. salicylová (obranné reakce), trans-skořicová (antiauxin) apod.

Organické dusíkaté látky • L- aminokyseliny - glycin (2 mg/l), glutamin (*) (150 -400), asparagin (100), cystein (10) • peptidy (*) nebo jejich ne přesně definované směsi: pepton, trypton kazein hydrolyzát (0, 2 -1 g/l)

Nedefinované doplňky media • kvasniční (yeast) a sladový (malt) extrakt, • kokosové mléko, pomeranč. , rajč. a mrkvový džus, banánový homogenát, březová míza • huminové sloučeniny

Moderátory p. H pufry Moderátory oxidace, produkce a kumulace fenolických látek aktivní uhlí (0, 1 - 0, 5%) pohlcuje i část RR! PVP - polyvinil pyrolidon (250 -1000 mg/l) k. askorbová a citronová (po 100 mg/l) -cystein (10 mg/l) thiourea, dithiothreitol L

Další doplňky media • Antibiotika * (penicilin, ampicilin, bacitracin, gramicidin, neomycin, nystatin, cefotaxim, ticarcilin, timentin, kanamycin aj. ) • Prekurzory a elicitory (produkce sekundárních metabolitů) • Odpěňovací prostředky (bioreaktory)

Ztužovací látky Agar (0, 6 -1%) - polymer galaktózy (agarózy) - z buněčných stěn řas (Sphaerococcus euchema, Gelidium a Gracilaria) • teplota (snese opakované roztavení) • p. H (optimum 5, 5 -5, 8) p. H<4 neztuhne • čistota

Ztužovací látky Gelrit (0, 2 -0, 35%) glukóza, glukuronová kyselina a rhamnóza - tetrasacharid gel jen za přítomnosti iontů Ca 2+ a Mg 2+ p. H 4 4. 92 g/L p. H 5 2. 93 g/L p. H 6 1. 36 g/L p. H 7 0. 64 g/L p. H 8 0. 50 g/L p. H 9 0. 40 g/L • čirý • nesnese opakované zahřátí!

Ztužovací látky • Phytagel (Mg, Ca) • biogel P 200 (polyacrylamidová blanka) • • agargel (směs agaru a synt. gelu) alginát (protoplastové kultury) agaróza rozpustný škrob

Osmotika manitol, inositol PEG 4000 - polyetylene glycol

p. H • Po autoklavování pokles o cca 0, 3 -0, 5 (p. H 4, 5 a 7 hranice; p. H 5 -6 optimum)