Plzmdu DNS superspiralizcijas ietekm uz tjs klontu gnu

Plāzmīdu DNS superspiralizācijas ietekmē uz tājās klonētu gēnu ekspresijas līmeni Escherichia coli šūnās Jana Sočņeva Gaļina Makarenkova Irina Sominska LU MIKROBIOLOĢIJAS UN BIOTEHNOLOĢIJAS KATEDRA LU BIOMĒDICINAS STUDIJU UN PĒTĪJUMU CENTRS

Lai gan DNS divpavedienu struktūra tika noskaidrota jau pirms piecdesmit gadiem, priekšstati par tās topoloģijas lomu šūnā notiekošo procesu regulācijā veidojās samērā nesen.

§ Gredzenveida divpavedienu plazmīdu DNS molekulas baktēriju šūnā pastāv superspiralizētā formā. § DNS superspiralizācija var but pozitīva un negatīva. . § Superpiralizācijas pakāpe var mainīties: § DNS replikācijas laikā § topoizomerāžu iedarbības rezultāta § DNS molekulai apvijoties ap proteīniem – piemērām RNS polimerāzi.

§ DNS superspiralizācijai ir liela loma daudzos šūnā notiekošajos procesos. § Transkripcijas un replikācijas laikā plazmīdu DNS superspiralizācijas pakāpe mainās = plazmīdu superspiralizācijas pakāpe ietekmē gēnu ekspresijas līmeni baktēriju šūnās. § Tomēr DNS superspiralizācijas izmaiņas biotehnoloģiskiem mērķiem izmantojamās baktēriju kultūrās ir maz pētītas.

DNS superspiralizācija E. coli šūnās tiek regulēta kā kopējas šūnas homeostāzes daļa. Rekombinanatajos baktēriju celmos kuri tiek izmantoti dažadu svarīgu un vajadzīgu proteinu ražošanai bieži novērojamas nekontrolētas klonēto proteīnu gēnu ekspresijas izmaiņas, kuras nav saistītas: • ar plazmīdas mutācijām; • ar saimniekšūnas mutācijām • ar būtiskām izmaiņām šūnu augšanas fizioloģiskajos raksturlielumos.

• Par modeļobjektu pētnieciska darba izstrādāšani tika izmantoti klonētu cilvēka interferona IFN – 5 gēnu nesošas plazmīdas - p. IF 564 delēciju varianti, kuru interferona sintēzes spējas savstarpēji būtiski atšķīrās. • IFN – 5 gēnu izolēja no hromosomālās DNS bibliotēkas kā zondi izmantojot nepilnīgas c. DNS klonu (K. Henco, J. Brosius 1985). • Šī darba mērķis bija noskaidrot, vai plazmīdu DNS superspiralizācijas pakāpe ietekmē rekombinanta cilvēka interferona IFN – 5 sintēzi baktērijas Escherichia coli šūnas.

Darba gaitā tika strādāts ar: § E. coli TG 1 un XL Blue MR celmiem § p. IF 564 plazmīdu un tas delēcijas variantiem p. IF 693, p. IF 724 p. IF 728, p. IF 731, p. IF 733, p. IF 736, p. IF 803, p. IF 818, p. IF 564

Plazmīdu superspiralizācijas blīvuma mērījumi TG 1 p. IF 693 XL p. IF 693 6 h 10 h 24 h

Plazmīdas p. IF 564 un tas delēciju variantu DNS superspiralizāciju ietekmē: Baktēriju saimniekšūnu ģenētiskais fons un fizioloģiskais stāvoklis

Novērota korelācija starp rekombinanto plazmīdu superspiralizāciju un IFN - 5 proteīna ekspresijas līmeni – proteīns tiek sintezēts E. coli TG 1 celmā, kur plazmīdas ir vairāk superspiralizētas un lielākā skaitā neka XL Blue MR celmā, kur IFN sintēze praktiski nav novērojama

Proteīna uzkrāšanas notiek sākot ar 15 – 24 stundu, sintēze efektīvāk notiek šūnās, kur plazmīdas šajā laikā ir vairāk relaksētas nekā šūnās, kur plazmīdas ir ilgāk saglabājušas lielu superspiralizācijas blīvumu Rekombinānto plazmīdu superspiralizācijas izmaiņas (Rf) E. coli TG 1 augšanas ciklā Rekombinanta IFN - α 5 produktivitāte Tg 1 celmā kultūras augšanas ciklā

Ievērojot to, ka pētītās plazmīdas izmantotie replikācijas un gēnu ekspresijas regulācijas elementi ir identiski, var secināt, ka gēnu ekspresijas efektivitātes atšķirības vienā un tajā baktēriju celmā ir atkarīgas no replikona topoloģijas (superspiralizācijas) īpatnībām.

§ Par modeli tālākiem pētījumiem DNS superspiralizācijas lomas noskaidrošanai uz klonēto gēnu ekspresiju tika izvēlēts HBVc antigēna gēns. HBV kora proteina - HBVc § Šīs proteīns spontāni savācas un veido 27 nm kora daļiņas pat bez citu HBV proteīnu klātbūtnes. § Šīs HBc proteīns ir imunogēns un inducē organisma augstu anti-HBc titru HBV infekcijas laikā ka arī imunizējot dzīvniekus.

HBV - Kora proteins - HBc

§ Darbā tika izmantots HBc pilna garuma savvaļas fenotipa un HBc saīsinātais gēna variants. § Tie tika veiksmīgi ieklonēts p. TVI un p. IF 693 (labākās IFN - 5 producēts) plazmīdas Eco. RI (labākās saitā, IFN - 5 vietā. Ka rezultāta tika iegūtās , jaunas konstrukcija. § Tika pārbaudīts arī HBc pilna un HBc saīsināta ekspresijas līmenis E. coli TG 1 celmā.

Iegūto plazmīdu restrikcijas kartes p. TVI+HBc full p. HBc-JA-1 p. TVI+HBc short p. HBc-JA-3 HBc full p. IF 693+HBc full HBc short p. IF 693+HBc short p. HBc-JA-2 p. HBc-JA-4 HBc full HBc short

HBc proteīna analīze SDS – PAA elektroforēzes gelā Kont. JA-1 JA-2 JA-3 JA-4 20. k. Da 14 k. Da HBc pilna garuma 22 k. Da HBc saisinātais variants 15 k. Da

Paldies par uzmanību!