PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer PCR

PCR • Scelta dello stampo • Scelta dei primer

PCR da DNA genomico

PCR da m. RNA (RT-PCR)

Uso dei “linkers”

Vettori d. A: d. T 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’

PCR da DNA genomico Ba m. H Bam. HI I Ec o. R I Eco. RI

Proteine di fusione prom Tag o rep. c. DNA trascrizione traduzione term

Elettroforesi di acidi nucleici • Gel di agarosio • Gel di acrilammide

Elettroforesi su gel di agarosio

Tamponi di elettroforesi

Soluzioni di caricamento

Soluzioni di caricamento • Aumentano la densità del campione • Colorano il campione • Rendono visibile la corsa elettroforetica

Migrazione del DNA su gel

Fattori che influenzano la migrazione • Peso molecolare • Concentrazione di agarosio • Conformazione DNA • Voltaggio applicato • Intercalanti • Tampone di elettroforesi

Visualizzazione del DNA

Marcatori di peso molecolare Hind. III

Fotodocumentazione

Recupero DNA da gel • Elettroeluizione • Agarosio “low melting” • Solubilizzazione agarosio

Gel di acrilammide

Apparato per gel di acrilammide

Metodi di sequenziamento • Sanger (enzimatico) • Maxam e Gilbert (chimico)

Metodo di Sanger primer quattro d. NTP (incluso 32 Pd. NTP) DNA polimerasi dd. TTP dd. CTP dd. GTP dd. ATP primer nuovo DNA dideossinucleotide terminatore La catena neosintetizzata termina quando un dd. NTP è incorporato al posto di un d. NTP Denaturare e separare su gel di poliacrilammide

Metodo di Maxam e Gilbert P 32 DNA singolo filamento marcato ad una estremità 4 o 5 reazioni di modificazione base -specifiche Es. metilazione dimetilsolfato delle G con Rottura del filamento in corrispondenza della base modificata mediante piperidina Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide

Gel di poliacrilammide di sequenza

Fasi di un progetto di sequenziamento • clonaggio e preparazione del DNA • reazioni di sequenza • elettroforesi su gel di poliacrilammide • interpretazione e raccolta dati

Vettori a singolo filamento

Fagemidi

Strategie di sequenziamento • Primer specifici consecutivi • Delezioni progressive • Frammenti casuali (shotgun)

Reazioni base-specifiche

Confronto metodi di sequenziamento Sanger Maxam e Gilbert rapida e semplice attuazione lunga preparazione del DNA disponibilità di kit reazioni da mettere a punto necessità di primer relativamente economico sensibile a strutture secondarie strutture non influenti utilizzabile per oligonucleotidi

Sequenziamento automatico

Sequenziamento con Taq polimerasi