PCR Polymerase Chain Reaction 02 Introduction PCR cycling

PCR (Polymerase Chain Reaction) Ⅰ

계대배양 02 Introduction PCR 과정 cycling

계대배양 02 Introduction Step 1 : Denaturation • 두 가닥의 DNA를 약 94℃에서 15~30초간 처리 • Double strand DNA → Single strand DNA

계대배양 02 Introduction Step 2 : Annealing • 약 50~65 ℃ 정도로 온도를 떨어뜨려 분리된 ss. DNA에 상보적인 sequence 를 갖는 primer가 결합 • Primer의 Tm 값에 의해 온도결정 Antisense strand 5’ 3’ 5’ 5’ Forward primer Reverse primer Sense strand 5’ 3’

계대배양 02 Introduction Step 2 : Annealing • Primer 제작 5’-ATGGCGGAGGCTGCAACTCCCGGAAAAATT-3’ 3’-TTTTAA-5’ 5’-ATGGCG-3’ 3’-TACCGCCTCCGACGTTGAGGGCCTTTTTTAA-5’ • 좋은 Primer 조건 – – 20~25 mer Primer 간의 상보성 X GC 함량 너무 높지 X 두 primer의 Tm값이 비슷 • Temperature of melting (Tm 값) *Tm 값 = {4(G+C)} + {2(A+T)} ℃

Tm 온도가 너무 높을 때 -primer가 tamplate에 붙지 않음 Tm 온도가 너무 낮을 때 -non-specific binding ↑ Tm 온도가 맞을 때 -specific binding

계대배양 02 Introduction Step 3 : Extension • Taq DNA polymerase의 최적 활성온도인 약 68~72 ℃ 에서 진행 *호열성 세균인 Thermus aquaticus에서 유래하는 내열성 DNA중합효 소 • Annealing 단계에서 결합된 primer의 3’-OH에서부터 d. NTP를 하나씩 첨가 하여 extension Antisense strand 5’ 3’ 5’ Forward primer Taq 5’ Sense strand Reverse primer 5’ 3’

계대배양 02 Introduction Gel electrophoresis -PCR을 통해 증폭된 DNA product를 확인하는 방법

계대배양 03 Materials & Methods PCR product 만들기 : DDW, PCR master Mix, DNA template, Primer, Pipette, Tip, PCR machine 1. 다음 표를 참고하여 PCR solution을 만든다. 2. Tapping으로 섞어준 후 spin-down. 3. PCR machine에 온도 시간 설정 후 작동시킨다. Master Mix 15µl DNA template 2µl Primer (Forward) 1µl Primer (Reverse) 1µl DDW 11µl total 30µl

계대배양 04 Result