PCR metoda Nensi Aramini mag med lab diagn

PCR metoda Nensi Araminčić, mag. med. lab. diagn. , nastavnica savjetnica Nastavni predmet: Instrumentalne metode Obrazovna razina: 3. razred Obrazovni program: Zdravstveno-laboratorijski tehničar/ka Medicinska škola u Rijeci

Značenje PCR metode. . . ?

Definicija PCR • PCR – polimeraza lančana reakcija (eng. Polymerase Chain Reaction) - metoda kojom se kratki dio molekule DNA umnožava u veliki broj identičnih kopija • Ciljni dio DNA molekule koju se želi umnožiti određuje se kratkim oligonukleotidnim sekvencama – primerima • Primeri - pokretači serije reakcija pomoću enzima DNA polimeraze, koja na kalupu jednog lanca DNA sintetizira novi, komplementarni lanac

Upotreba PCR metode. . . ?

Primjena PCR metode • • • u mikrobiologiji u virologiji u dijagnostici nasljednih bolesti u forenzici u dijagnostici malignih bolesti u proizvodnji “pametnih lijekova”. . . https: //www. youtube. com/watch? v=i. Qsu 3 Kz 9 NYo (PCR – animacija)

Izvođenje PCR metode. . . ?

Postupak • Dvostruki lanac DNA molekule se razdvoji zagrijavanjem na 94°C kroz 3 min. • Tijekom hlađenja na 50 – 60°C primeri se komplementarno vežu (annealing) • Taq-polimeraza započinje sintezu komplementarnih lanaca (extension) dodavanjem komplementarnih baza • Prosječna PCR reakcija se odvija u 30 do 35 navedenih ciklusa

PCR ciklus Faze PCR ciklusa: Broj ciklusa - 30 DENATURACIJA 94°C; 2 do 5 min VEZANJE PRIMERA (ANNEALLING) - 55°C; 30 – 60 sek SINTEZA (ELONGACIJA DNA LANCA) -72°C; 30– 120 s (ovisno o duljini PCR produkta) • ZAVRŠNA SINTEZA - 72°C; 5– 7 min (završno djelovanje Taqpolimeraze). • HLAĐENJE - reakcija će konačno ohladi na 4°C • • •

Faze PCR ciklusa • Denaturacija • Annealling • Elongacija

Broj kopija umnožene DNA Ciklus Broj kopija 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1. 048. 576

Rast broja kopija DNA u PCR ciklusima

PCR oprema – PCR termoblok

Za izvođenje PCR potrebno je. . . • Termostabilna DNA polimeraza • Uzorak DNA (50 do 100 ng u prosjeku) koja će biti kalup za kopiranje komplementarnog DNK lanca - niza • Dva odgovarajuća oligonukleotidna primera • Reakcijski pufer • Nukleotidi: adenin, timin, citozin i gvanin (A, T, C i G)

Enzim Taq-polimeraza • Vrsta termostabilne DNA –polimeraze izolirane iz bakterije Thermus aquaticus (T-aq) • Optimalna temperatura za enzimsku aktivnost kreće se između 72 i 74°C • Taq-polimeraza može kopirati DNK lanac od 1. 000 parova baza za manje od 10 sekundi na radnoj temperaturi od 72 °C – eksponencijalna replikacija DNA

Ponovimo • Definiraj PCR metodu! • Navedi enzim odgovoran za esponencijalnu replikaciju DNA! • Kolika je količina DNA potrebna kao uzorak? • Nabroji osnovne faze PCR ciklusa! • U koliko ciklusa se postupak ponavlja? • Navedi nekoliko primjera primjene PCR metode!

Zaključimo • PCR – metoda umnažanja male sekvence molekule DNA u veliki broj identičnih kopija • Odvija se u 3 osnovne faze PCR ciklusa: denaturacija, annealling, elongacija • PCR teče u prosječno 30 ciklusa • Ključan enzim je Taq-polimeraza – kopira dio molekule DNA od interesa • Primjena PCR metode: u mikrobiologiji, u virologiji, u forenzici, u dijagnostici malignih bolesti, u proizvodnji “pametnih” lijekova