PCR en temps rel PCR quantitative But 1

PCR en temps réel (PCR quantitative)

But 1. Comprendre la difference fundamentale entre la PCR en temps réel and la PCR traditionnelle 2. Comprendre les calculs de base pour la quantification avec la PCR en temps réel 3. Comprendre les differences entre la PCR en temps réel et le transfert Northern

Applications de la PCR en temps réel • Méthode quantitative puissante – Expression génique – Détermination/suivi de la charge virale – Quantification de gènes cancerigène – Vérification de biopuce – Vérification de transgène – Analyses de SNP

Étapes de la PCR en temps réel Quantité de produit de PCR • Trois phases Plateau Phase linéaire Phase exponentielle Nombre de cycles

Amplification exponentielle Xn = X 0 * (1 + E) n Xn = Copies d’ADN au cycle n X 0 = Copies d’ADN au cycle 0 E = Efficacité d’amplification n = Nombre de cycles E = [10(– 1/pente)] – 1 (Efficacité = 1 dans la phase exponentielle)

Système de détection quantitatif • Détection de la fluorescence • Deux types de fluorochromes – Ceux qui se lient à l’ADN double brin – Sondes à ADN avec fluorochrome

SYBR green (Lie l’ADN double brin) Plus commun SYBR green

Sondes avec fluorochromes (FAM, VIC, TET, FRET) Moins commun Fluorochrome Atténuateur

SYBR green Vs. • Ne discrimine entre le gène d’interêt et d’autres ADN (e. g. contamination) • Ne permet pas la PCR multiplex • Moins d’étapes requises • Moins coûteux Sondes avec fluoro. • Discrimine, plus spécifique • Permet la PCR multiplex avec usage of different fluoro. • Requiert moins d’étapes • Plux coûteux

Zones de détection PCR en temps réel vs PCR trad. Quantité de produit de PCR traditionnelle Et. Br Nombre de cycles PCR en temps réel

Quantification de l’amplicon de PCR en temps réel • Augmentation de la fluorescence est proportionnelle à l’amplification d’ADN • Le premier cycle auquel l’instrument peut déterminer l’augmentation de fluorescence comme étant au dessus du bruit de fond est le cycle seuil “Ct” (threshold cycle)

Le cycle seuil (Ct) Exemple de Ct Ct

Le cycle seuil (Ct) Ct de trois différents échantillons

Le cycle seuil (Ct) • Le Ct est inversement proportionnel à la concentration initiale d’un échantillon – e. g. Plus la concentration d’ADN est grande plus la valeur du Ct est petite

Méthodes quantitatives 1. Quantification absolue – Pour déterminer la quantité exacte d’ADN (e. g. charge virale) 2. Quantification relative – Pour déterminer le changement d’expression génique

Quantification absolue • Si la quantité initiale d’DNA est connue: XT = X 0 * (1 + E) Ct XT = quantité d’ADN au cycle seuil X 0 = quantité d’ADN au cycle 0 E = efficacité d’amplification Ct = cycle seuil • Si non, les Ct des échantillons doivent être comparés à ceux d’une courbe d’étalon

Quantification absolue Echantillon du gène Mel 1 dont le Ct après amplification est 22. 5 cycles. Quelle est la concentration de l’amplicon? Courbe d’étalon 25. 00 23. 00 R 2 = 0. 9993 Cycles 21. 00 19. 00 17. 00 15. 00 -1. 6 -1. 4 -1. 2 -1 -0. 8 -0. 6 Log of DNA concentration -0. 4 -0. 2 0

Quantification absolue Concentration de l’amplicon de Mel 1 Ct de 22. 5 y = -3. 1392 x + 18. 221 22. 5 = -3. 1392 x + 18. 221 x = -1. 3630 10 -1. 3630 (Log inverse de 10) La concentration d’ADN est 0. 043 µg/ml

Quantification relative • Normaliser le gène d’interêt à un gène domestique Rapport Échantillon Gène domestique

PCR en temps réel Vs. • Plus sensible (besoin ~50 ng d’ADN) • Plus précis (peut déterminer no copies) • Matrice d’ADN (stable) • Ne donne pas la taille des transcrits • Plus rapide (juste quelques heures) • Moins d’étapes impliquées Transfert northern • Moins sensible (besoin de ~10 ug d’ADN) • Moins précis (ne peut pas déterminer no copies) • Matrice d’ARN (instable) • Donne la taille des transcrits • Long (Plusieurs heures à jours) • Beaucoup d’étapes impliquées