Patogeneza reumatoidalnego zapalenia staww rola szpiku kostnego Wodzimierz

Patogeneza reumatoidalnego zapalenia stawów: rola szpiku kostnego Włodzimierz Maśliński Zakład Patofizjologii i Immunologii Instytut Reumatologii Warszawa

Zdrowy staw RZS chrząstka Zdrowa błona maziowa Spoczynkowe: Synowiocyty makrofagalne Synowiocyty fibroblastyczne Zdegradowana: chrząstka kość Płyn stawowy RZS Błona maziowa w RZS Aktywowane: synowiocyty makrofagalne synowiocyty fibroblastyczne, makrofagi, limfocyty T, limfocyty B, komórki: NK, Aktywowane: Granulocyty, limfocyty T, limfocyty B, makrofagi komórki NK, płytki krwi tuczne, plazmatyczne, angiogeneza Modified from Panayi et al. NEJM, 2001; 344: 907 -16

Obrzęk szpiku i nacieki komórkowe w RZS Mc. Queen FM and Ostendorf B, AR&T 2006, 8: 222

Szpik kostny w zwierzęcych modelach zapalenia stawów 1. 2. 3. Podczas wczesnych etapów kolagenowego zapalenia stawów (CIA) (przed objawami zapalenia stawów) obserwuje się powiększenie kanałów łączących szpik ze stawami oraz migrację nimi komórek mezenchymalnych. Terapia anty-TNF blokuje te zjawiska. Marinova-Mutachieva et al. 2002, Arthritis Rheum 46: 507 Podczas adjuwantowego zapalenia stawów DNA z mykobakterii jest znajdowane w szpiku i śledzionie, ale nie w stawach. Ronaghy et al. J. Immunol. 2002, 168: 51 Zapalenie stawów indukowane antygenem może być przeniesione do zdrowych myszy przez przeszczep szpiku, co wskazuje na Kobayashi et al. J. Rheumatol. 2002, 29: 1176 4. Efektywna prezentacja antygenu (kilkukrotnie lepsza niż w węzłach chłonnych) zachodzi w szpiku kostym M. Feuerer; Nat Med 2003; 1151 -7

Szpik kostny w RZS • Udział podchrzęstnego szpiku w RZS Bugatti et al. 2005, Arthritis Rheum 52: 3448 • Obrzęk szpiku kostnego w RZS Mc. Queen and Ostendorf. Arthritis Res & Therapy. 2006, 8: 222, • Nadżerki kości i obrzęk szpiku kostnego odzwierciedlają prawdziwe zapalenie szpiku w RZS Jimenez-Boj at al. Arthritis and Rheum. 2007, 56: 1118

Zagadnienia • Mikrośrodowisko szpiku bogate w cytokiny prozapalne promują dojrzewanie i aktywację osteoklastów • Subpopulacje limfocytów w szpiku kostnym: rola IL 15? • Komórki regulatorowe w szpiku kostnym • Funkcjonalne receptory Toll-podobne (TLR) są obecne na limfocytach B w szpiku kostnym

Elevated levels of TNFa in bone marrow plasma from RA in comparison to OA patients P=0, 04 OA RA Warnawin et al. in preparation

Elevated levels of IL-1β in bone marrow plasma from RA in comparison to OA patients P=0, 03 OA RA Warnawin et al. in preparation

Increased levels of IL-15 in RA bone marrow A B 1800 7, 0 6, 5 1600 1400 1200 * 1000 800 IL - 7 ( pg /ml) IL-15 (pg/ml) 6, 0 5, 5 5, 0 4, 5 4, 0 3, 5 3, 0 600 2, 5 400 2, 0 200 RA BM OA BM 1, 5 RA BM OA BM Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010 (in press)

Soluble gp 130 blocks IL-6/IL-6 R active complex IL-6 s. IL-6 R Active complex sgp 130 IL-6 R gp 130 IL-6/s. IL-6 R/sgp 130 - inactivated complex signaling

Levels of IL-6, s. IL-6 R and sgp 130 in bone marrow isolated from RA and OA patients IL-6 s. IL-6 R - RA • • sgp 130/IL-6 sgp 130/s. IL-6 R - OA Lower level of sgp 130 in RA compensate less IL-6 and s. IL-6 R than in OA Thus, IL-6/IL-6 Ra system forms better microenvironment in bone marrow to activate asteooclasts in RA

RANKL, RANK and OPG regulates maturation, activation and survival of osteoclasts Receptor activator of NF-k. B ligand - RANKL CFU- M Receptor activator of NF-k. B – RANK preosteoclast Osteoprotegerin - OPG multinucleated osteoclast Pro-resorptive hormones, Cytokines , growth factors activated osteoclast Bone osteoblasts or bone marrow stromal cells CFU- M hormones, cytokines, growth factors apoptotic osteoclast Bone osteoblasts or bone marrow stromal cells Adapted from Boyle WJ, et al. Nature 2003; 423: 337 - 42.

Levels of soluble RANKL and OPG in bone marrow plasma OPG n. s. 24000 20000 16000 12000 8000 4000 0 200 RANKL concentrations (pg/ml) OPG concentrations (pg/ml) 28000 OA RA 180 RANKL P < 0. 001 800 700 160 OPG/RANKL ratio P < 0. 001 600 140 500 120 400 100 80 300 60 200 40 20 100 0 0 OA RA Lower OPG/RANKL ratio in RA than in OA suggests that osteoclast maturation/activation microenvironment in RA bone marrow contributes to faster bone degradation Radzikowska et al. in preparation

Wnioski: Podwyższone poziomy cytokin prozapalnych (TNF-a, IL-1 beta, IL-6, IL-15, IL-17) oraz wyższy stosunek RANKL/OPG stwarza w szpiku kostnym mikrośrodowisko promujące zapalenie i degradację kości

Limfocyty T w szpiku kostnym w RZS

Increased absolute T cell number and CD 4+/CD 8+ ratio in rheumatoid B 14000 CD 3+CD 4+ /CD 3+CD 8+ ratio A p<0. 008 12000 * 10000 8000 6000 4000 2000 0 RA OA C 1, 4 1. 4 p<0. 004 1, 3 1, 2 1, 1 1. 1 * 1, 0 1. 0 0, 9 0, 8 0, 7 0, 6 0, 5 0. 5 RA OA 80 70 60 50 ESR Number of CD 3+ cells/ml of bone marrow arthritis (RA) bone marrow in comparison to osteoarthritis (OA) p<0. 05 40 30 R= - 0. 54 20 10 0 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 Number of CD 3+ cells/μl of RA bone marrow Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010 (in press)

Increased expression of early activation marker CD 69 on RA bone marrow CD 4+ and CD 8+ T-cells C 7 CD 3+CD 4+CD 69+ (%) 6 5 # * P<0. 05 RA BM RA PB 5, 5% CD 69 A 0% P<0. 005 4 3 OA BM # 2 OA PB 0, 3% 0% 1 0 -1 CD 4 RA BM RA PB OA BM OA PB CD 3+CD 8+CD 69+ (%) 18 16 # ^ RA BM D P<0. 01 RA PB 17, 3% 0% CD 69 B 20 P<0. 005 14 12 10 8 6 # P<0. 005 OA BM OA PB 0, 3% 0% 4 2 0 -2 RA BM RA PB OA BM OA PB CD 8 Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010 (in press)

Proliferation of bone marrow T cells triggered by IL-15 + CD 4+ RACD 3+ RA RA RA CD 3 Cell number CD 3 OA CD 3+ CD 4+ + + OA CD 3 CD 4 + CD 3+ CD 8+ + CD 8 + + OA OA CD 3 + CD 8 + CD 3+ CD 4+ CD 8 + CFSE Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010 (in press)

Formation of germinal centers in early and advanced RA bone marrow Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010 (in press)

Czy komórki regulatorowe hamujące odpowiedź immunologiczną są w szpiku kostnym chorych na RZS?

Higher percentage of CD 4+Foxp 3+ cells in bone marrow of OA than RA patients P<0, 05 Massalska et al. In preparation

Limfocyty T w szpiku kostnym chorych na RZS • Aktywowane, limfocyty T CD 4+, CD 8+ są obecne w • Wykazuja wyższą ekspresję recptorów dla IL-15 • Pod wpływem IL-15 proliferują i wydzielają IL-17 • Zwiększone proporcje Th 17 i IL-17 • Obniżone poziomy Fox. P 3+, komórek regulatorowych Treg • Tworzenie w szpiku kostnym typowych dla węzłów chłonnych centrów rozrodczych z aktywowanymi limfocytami T i B zarówno we wczesnym jak i zaawansowanym RZS

Funkcjonalne receptory Toll-podobne 9 (TLR 9) są obecne w limfocytach B pochodzących ze szpiku pacjentów z RZS Rudnicka et al. Eur. J. Immunol. 2009, 39, 1211 -20

Indukcja i podtrzymywanie odpowiedzi immunologicznej: dwa sygnały, kostymulacja, zagrożenie !!! PAMP, DAMP- PRR: TLR, NLR, RAGE (P. Matzinger 1994, 2004 -2007) bakteria Kostymulacja (B 7. 1, B 7. 2, /CD 28, CD 40/CD 40 L. . . ) Sig. 1 B Sig. 1 TLR bakter C AP Help (sygnał 2) (IL-2, 4, 5. . ) ia Th Cytokiny PPR- pattern recognition receptors TLR- Toll-like receptors NLR- NOD-like receptors RLR- RIG-I-like receptors RAGE- receptor for advanced glycation end-products PAMP Sygnały zagrożenia (Cząsteczki DAMP) komórka uszkodzona PAMP – pathogen associated molecular patterns DAMP – damage associated molecular pattern zdrowa Ciałka apoptotyczne)

RA bone marrow-derived B-cells express TLR 9 at m. RNA and protein levels Expression of m. RNA encoding TLR 9 bone marrow 1 2 3 4 peripheral blood TLR 9 (260 bp) - RT GAPDH (196 bp) Expression of TLR 9 protein – saponin 0, 9 42, 1 2, 9 TLR 9 Isotype control + saponin CD 19 % of CD 19+ cells expressing TLR 9 Rudnicka et al. Eur. J. Immunol. 2009, 39, 1211 -20

Cp. G-ODN, but not Gp. C-ODN, enhance directly and in a dose-dependent manner, the expression of activation markers (CD 86 and CD 54) on bone marrow B-cells Control Gp. C-ODN 30 mg/ml Untreated cells 15 mg/ml 3, 9 2, 2 Agonistic Cp. G-ODN 30 mg/ml 21, 4 14, 8 CD 19 Pure B-cells culture CD 86 CD 54 BMMC culture CD 86 1, 5 Control Gp. C-ODN 30 mg/ml Untreated cells 15 mg/ml 6, 9 Agonistic Cp. G-ODN 25, 1 30 mg/ml 33, 8 CD 19 Control Gp. C-ODN Agonistic Cp. G-ODN, 15 mg/ml Agonistic Cp. G-ODN, 30 mg/ml CD 54 Rudnicka et al. Eur. J. Immunol. 2009, 39, 1211 -20

Chloroquine (inhibitor of TLR 9 signaling) inhibits Cp. GODN-triggered CD 86 and CD 54 expression on bone marrow B-cells Agonistic Cp. G-ODN Untreated cells Chloroquine + agonistic Cp. G-ODN 16, 4 2, 7 2, 9 19, 3 4, 2 CD 54 CD 86 2, 5 CD 19 Rudnicka et al. Eur. J. Immunol. 2009, 39, 1211 -20

Cp. G-ODN stimulate proliferation of bone marrow B-cells in BMMC culture (increased Ki-67 expression and diminished CFSE content in CD 19+ cells) Ilość komórek n=4 n=3 Agonistic Cp. G-ODN, 30 mg/ml Agonistic Cp. G-ODN, 15 mg/ml Control Gp. C-ODN, 30 mg/ml D=0, 24 Ki-67 -FITC % of CD 19+ cells CD 19 -PE 3, 6 Unstimulated control 20, 1 4, 3 Control. Gp. CODN CFSE Agonistic Cp. G-ODN Rudnicka et al. Eur. J. Immunol. 2009, 39, 1211 -20

Cp. G-ODN induce IL-6 and TNF-a secretion by bone marrow B-cells IL-6 TNF-a ns Untreated Control Agonistic control Gp. C-ODN Cp. G-ODN 60 hours of the cell culture p = 0, 02 TNF-a (% of untreated control) IL-6 (% of untreated control) p = 0, 02 ns Untreated Control Agonistic control Gp. C-ODN Cp. G-ODN Rudnicka et al. Eur. J. Immunol. 2009, 39, 1211 -20

Bone marrow CD 20+ B-cells express TLR 9 A bone marrow peripheral blood CD 20+ CD 20 low CD 20 - CD 19 p=0. 049 TLR 9 (% of CD 19+ cells) B 100 - 80 - 60 40 ns - 20 - 0 CD 20 - CD 20 low CD 20+ TLR 9 (Mean Fluorescence Intensity) bone marrow C 80 - 64 - CD 20+ peripheral blood ns 48 32 16 - 0 bone marrow peripheral blood Rudnicka et al. Eur. J. Immunol. 2009, 39, 1211 -20

Bone marrow CD 20+ B-cells respond better to Cp. GODN stimulation than their peripheral blood counterparts BMMC PBMC Rudnicka et al. Eur. J. Immunol. 2009, 39, 1211 -20

Bacterial 16 S r. RNA / human b-globin DNA ratio Higher frequency of bacterial DNA in bone marrow samples from RA than OA patients median p = 0, 0079 25 th-75 th percentiles within confidence interval Rudnicka et al. Eur. J. Immunol. 2009, 39, 1211 -20

B-cell maturation in bone marrow Cells Surface antigens Stem cells TLR 9 Pro-B Pre-B Immature B Mature B Activated B Memory B Plasma cell ?

Podsumowanie i wnioski (i) Limfocyty B pochodzące ze szpiku pacjentów z RZS wykazują ekspresję funkcjonalnych receptorów TLR 9, które uczestniczą w ich aktywacji, produkcji TNF-a i IL-6, proliferacji i różnicowaniu do komórek o fenotypie CD 19+CD 20+CD 27 high in vitro (ii) IL-15 zwiększa: indukowany agonistami TLR 9 (Cp. G-ODN) wzrost ekspresji CD 86 i CD 54, proliferację i promuje dalsze różnicowanie limfocytów B CD 19+CD 20+CD 27 high w kierunku komórek plazmatycznych (CD 138+CD 19 low. CD 20 low) (iii) Podwyższona częstotliwość eubacteryjnego 16 S-rybosomalnego RNA in próbkach szpiku od pacjentów z RZS w porównaniu OA wskazuje na rolę bakteryjnych infekcji w patogenezie RZS (iv) Agonistyczne Cp. G-ODN poprzez TLR 9 indukują ekspresje IL-15 i IL 15 Ra w jednojądrowych komórkach pochodzących ze szpiku (BMMC) Te dane wskazują na udział ligandów TLR 9 i IL-15 w aktywacji szpikowych limfocytów B i sugerują udział w patogenezie RZS

Wnioski • Szpik kostny jest wtórnym organem limfatycznym, który aktywnie uczestniczy w inicjacji i podtrzymywaniu chronicznego zapalenia w RZS • Przyszłe terapie RZS powinny brać pod uwagę szpik kostny jako jedną z istotnych lokalizacji aktywowanych komórek

Podziękowania Zakład Patofizjologii i Immunologii Tomasz Burakowski Ewa Kontny Magdalena Chorąży-Massalska Anna Radzikowska Weronika Rudnicka Ewa Warnawin Maria Ziółkowska Klinika Reumoortopedii Paweł Małdyk Cezary Michalak Leszek Jung Jacek Kowalczewski Zakład Anatomii Patologicznej Monika Prochorec-Sobieszek