Pathologie des cancers du sein Classification histopathologique Caractres

Pathologie des cancers du sein • Classification histopathologique • Caractères histopronostiques • Marqueurs biologiques Dr Xavier Sastre-Garau, Département de Biopathologie, Institut Curie, Paris xavier. sastre@curie. net

Histologie mammaire canal lobule Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Histologie mammaire: canal Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Histologie mammaire: lobule Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Aspects marcroscopiques des cancers du sein Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Aspects macroscopiques des cancers du sein Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Classification histologique • • • Les cancers infiltrants - carcinome canalaire infiltrants - carcinome lobulaire infiltrant - carcinome médullaire - carcinome mucineux - autres types Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris 85% 10% 1% 2% 3%

Carcinome canalaire infiltrant Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome canalaire infiltrant Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome lobulaire infiltrant Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome lobulaire infiltrant Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome lobulaire infiltrant Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome lobulaire infiltrant Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Perte de la E-Cadhérine dans les carcinomes lobulaires Carcinome canalaire Carcinome lobulaire Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome médullaire Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome médullaire Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome mucineux Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome mucineux Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome apocrine Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Caractères histopronostiques • Taille • Grade: différenciation, atypies, mitoses • Embolies tumorales • Statut ganglionnaire: méthodes d’analyse du ganglion sentinelle Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Index histopronostique • Différenciation • 1: > 75% de formation glandulaires • 2: 10 -75% de formations glandulaires • 3: <10% de formations glandulaires Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome bien différencié Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome bien différencié Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome peu différencié Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Index histopronostique Pléomorphisme nucléaire • 1: noyaux petits, réguliers, uniformes • 2: noyaux modérément pléomorphes • 3: noyaux atypiques et nucléolés Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Index histopronotique • Index mitotique • sur 10 champs consécutifs (X 400) – 1: de 0 à 10 mitoses – 2 : de 11 à 22 mitoses – 3 : > 22 mitoses Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Index mitotique Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Index histopronostique (Index de Nottingham) • Grade 1: score global = 3, 4 ou 5 • Grade 2: score global = 6 ou 7 • Score 3: score global = 8 ou 9 Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

0. 6 0. 2 0. 4 Survival rate 0. 5 grade III 0. 0 Survival rate 0. 8 1. 0 Taux de survie sans métastase en fonction du grade histopronostique 0 24 60 120 180 Time (months) Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris 240 300

Embolies tumorales • • Lymphatiques ou veineuses Critères diagnostiques stricts En périphérie de la tumeur Valeur pronostique péjorative Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Embolies lymphatiques Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Embolies lymphatiques Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Extension métastatique ganglionnaire axillaire Terminologie TNM Taille Technique métastase p. N 1 > 2 mm standard p. N 1 mi 0. 2 -2 mm standard p. N 0 (i+) < 0. 2 mm immunohistochimie micro métastase Métastase occulte Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Evaluation histopathologique des ganglions sentinelles axillaires Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Evaluation per-opératoire des ganglions sentinelles Section médiane du ganglion – Analyse microscopique d’une cryocoupe – Si métastase: curage axillaire d’emblée Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Evaluation histopathologique des GS • Analyse de 3 sections histo-logiques standard pour la détection de métastase ou micrométastase • immunohistochimie pour la détection des métastases occultes Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Métastase occulte dans un GS axillaire Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

1. 8 mm 149 SN 74 patients Number of sections with immuno-labelled cells 150 m HES IHC 1 Number of new positive cases successively disclosed at each level 20 / 74 23/149 IHC 2 7 / 74 22/149 IHC 3 6 / 74 23/149 IHC 4 1 / 74 17/149 IHC 5 0 / 74 15/149 7 /149 Dr X Sastre-Garau, 107 / 894 (12%) Institut Curie, Paris IHC 6 1 / 74 35 / 74 (47. 3%)

Analyse des GS axillaires à l’aide de sections histologiques sériées et par immunohistochimie • Test sensible • La plupart des évènements détectés à l’aide de 3 sections • Procédure adaptée à l’étude des étapes précoces de la dissémination tumorale Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Analyse des GS axillaires série prospective de 879 cas • Métastases: 14. 4% (127/879) • Micro-métastases: 9. 1% (80/879) • Métastases occultes: 6. 5% (57/879) Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

0. 6 0. 2 0. 4 Survival rate 0. 5 N 1 -3 N+ >3 N+ 0. 0 Survival rate 0. 8 1. 0 Taux de survie sans métastase en fonction du statut ganglionnaire 0 24 60 120 180 Time (months) Dr X Sastre-Garau, Institut Curie. Paris 240 300

Cancers du sein : extension métastatique précoce dans la moelle osseuse Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Aspiration de la moelle en per-opératoire Séparation des cellules mononuclées par gradient de densité Numération Cytospots (106 cellules/lame) Immuno-cyto-chimie Analyse microscopique Résultats (287 cas) (2001 -2004) Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Mo 753 Mo 358 Métastases occultes Mo 695 Mo 381 Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Mo 817 Cellules cytokératines positives de signification indéterminée (CK+) Mo 728 Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Extension ostéo-médullaire précoce Taux de métastases occultes dans la moelle osseuse au moment du traitement initial des tumeurs mammaires de petite taille: 15. 3% (44/287) Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Comparaison entre le statut médullaire et le statut du GS axillaire Moelle osseuse N° de cas negative CK+ métastase occulte 174 60 (34. 5%) 89 (51. 1%) 25 (14. 4%) métastase 53 24 (45. 3%) 19 (35. 8%) 10 (18. 9%) micro métastase 22 9 (40. 9%) 10 (45. 5%) 3 (13. 6%) Métastase occulte 25 11 (44. 0%) 9 (36. 0%) 5 (20. 0%) Ganglion sentinelle négatif 274 p 104 127 Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris 43 0. 5

L’extension métastatique ganglionnaire axillaire n’est pas une étape nécessaire à l’extension métastatique ostéo-médullaire Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Marqueurs biologiques en pathologie mammaire • Récepteurs aux oestrogènes • Récepteur à la progestérone • c-erb B-2 • Prolifération (Ki 67) Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Récepteurs aux oestrogènes : méthode immunohistochimique Carcinome lobulaire infiltrant Dr X Sastre-Garau Institut Curie, Paris

Récepteurs à la progestérone : méthode immunohistochimique RP Carcinome mucineux Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Taux de prolifération (mib 1) Ki 67 Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Amplification et surexpression de HER 2 • Définition de l’amplification génique • Correlation entre amplification et surexpression: deux types d’analyses • Stratégie pour détermination du statut HER 2 • Aspects pratiques et recommandations Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

HER 2 oncogène, localisé en 17 q 21 Activation par amplification Surexpression protéique Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Détermination du statut HER 2 Statut génomique → Statut du gène − Hybridation in situ en fluorescence (FISH) Statut d’expression → Statut de la protéine − Immunohistochimie (IHC) Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Amplifications • Duplications d’un gène ou d’un groupe de gènes (amplicon) en de multiples copies (généralement plus de 10), indépendamment des gènes adjacents • Deux formes au niveau chromosomique: • - double minutes (dm) • MYCN in neuroblastoma • • - homogeneously staining regions (hsr) HER 2 dans les cancers du sein Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Amplification de HER-2: hsr FISH HER-2 hybridization on hsr Caryotype d’un cancer mammaire Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Document M. Muléris

Les cellules tumorales sont souvent aneuploïdes… Surtout dans les carcinomes de haut grade • polyploïdies • polysomies, monosomies • translocations déséquilibrées Sur-représentations chromosomiques Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris HER-2: 17 q 21. 1 A. AURIAS A. Aurias

FISH HER 2 HER-2 noyau cen 17 métaphase cen 17 HER-2 Amplification de HER 2 sur- représentation du chromosome 17 Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Surexpression fortes secondaires à amplification Surexpression de la protéine HER 2 Amplification du gène HER 2 Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Statut de HER 2 et traitement anti-HER 2 • Seulement les amplifications de HER 2 amplification conduisent à un haut niveau (>10 x) de surexpression de la protéine HER 2 • Les sur-representations conduisent à un faible niveau (<3 x) de surexpression de la protéine • La cible du Trastuzumab est la protéine HER 2 avec haut niveau d’expression (IHC 3+) • La réponse au Trastuzumab des cancers mammaires avec faible niveau de surexpresison de la protéine HER 2 n’est pas documentée • But: pour l’efficacité thérapeutique, détecter les haut niveaux de surexpression correspondant à une amplification génique Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Stratégie pour l’analyse du statut de HER 2 IHC ou FISH ? • IHC comme première étape • IHC: technique fiable après calibration par la FISH • Problèmes non résolus: • - altération possible d’épitopes après fixation • - artéfacts potentiels avec marquage non spécifique • - intensité de marquage correspondant à une variable continue pouvant être difficile à répartir par classe • - incomplete consensus on the rate of labeled cells • Indications de FISH restreintes aux cas 2+ par IHC Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

IHC HER 2: Recommandations • Standardisation des procédures de fixation et de préparation des sections histologiques • Automatisation • Calibration par la FISH • Contrôles inclus dans toutes les analyses • Règles d’interprétation • Contrôles de qualité interne et externe (AFAQAP, UKNEQUAS) Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Calibration de l’IHC • Calibration de la procédure • FISH • contrôles positifs et négatifs systématiques • Importance majeure du p. H du tampon pour le dénaturation thermique (p. H : 6) • Forte dilution de l’anticorps primaire CB 11 : 1/500 à 1/800 A 0485 : 1/ 1500 à 1/2000 Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Contrôles Négatif Canaux normaux Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Positif PAGET

Régles d’interprétation Score Immunomarquage Herceptin® 0 Pas de cellules marquée ou < 10% non 1+ Marquage faible et incomplet de >10% to 50 -60% cellules no 2+ Marquage faible ou modéré mais Oui seulement si complet et dans > 60% cellules amplification prouvée par FISH 3+ Marquage fort et complet dans > 60% cellules oui Vincent-Salomon et al. , 42: 337 -47, Histopathology, 2003 Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Taux de positivité attendus comme contrôle de qualité interne • Canalaire • • < 2 cm > 2 cm 10 to 15% 20 to 25% • • grade III • • Inflammatoire • Femme de moins de 35 ans 30% • Lobulaire < 5% 0% 11% 27% Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Surexpression forte de HER 2 (+++) Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Amplification forte de HER 2 (> 15 copies)

Surexpression modérée de HER 2 (++) Amplification faible (8 – 10 copies) de HER 2 ? Sur-representation sans amplification? Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Amplification forte mais altération de l’épitope ?

FISH pour la détermination du statut de HER 2 • Technique fiable – - reproductibilité supérieure à celle de l’IHC – - échecs identifiables – - variable discontinue (résultat numérique) • Plusieurs limitations: – équipement onéreux pour l’analyse microscopique – coût de l’analyse (135 €) plus élevé que celui de l’IHC – Formation spécifique requise • Deux indications en pratique: – calibration de l’IHC – détermination du statut de HER 2 dans les cas IHC 2+ Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

FISH HER 2 • Deux types de kits approuvés par la FDA • • - HER 2 probe seule • numbre de copies de HER 2 • • - mélange des sondes HER-2 + cen 17 taux entre HER 2 / cen 17 copies Buts: dans les cas d’immunomarquage ambigue, (++), (1) distinguer amplifications et sur-representations (2) éliminer de potentiels artéfacts Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Seuils pour un diagnostic d’amplification (littérature) • Variable: de ≥ 4 to ≥ 6 copies HER 2 (≥ 2 à ≥ 3 HER-2/cen 17) • La plupart des études: • Kit HER 2 : • . 1 -4 copies: • . ≥ 5 copies: Pas d’amplification Amplification • kit HER 2/cen 17: • . HER 2/cen 17 ≤ 2. 2: pas d’amplification • . HER 2/cen 17 >2. 2 : Amplification • seuil bas et arbitraire, non basé sur un rationel genetique • des sur-representations peuvent être rapportées comme des amplifications Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

FISH HER 2: recommandations • But: détecter de vraies amplifications conduisant à une surexpression forte • - HER 2: > 6 copies • - HER 2/cen 17: >3 • Présence d’amas de signaux (hsr) signant l’amplification. • Préciser le nombre de signaux de HER 2 • Vérifier le ratio HER 2/cen 17 si 6 -7 HER 2 copies • Garder des images pour contrôle de qualité Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Sélection des patientes pour le traitement anti -HER 2 (Institut Curie 2000 -2005) IMMUNOHISTOCHIMIE (4697 cas) Pas de surexpression : 80 % Surexpression: 20% Forte (3+) 64% Modérée (2+) 36% FISH Trastuzumab® + chimiothérapie Amplification 40% 56% 8 -12 copies 44% >15 copies Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris Pas d’amplification 60%

Les carcinomes triple négatifs • Définition immunophénotypique – RO– RP– ERBB 2 • Carcinome canalaire infiltrant de haut grade • Types histologiques spécifiques – Carcinome apocrine – Carcinome lobulaire pléomorphe… Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Les carcinomes de type basal-like • Un sous groupe des carcinomes « triple négatifs » • Immunophénotype caractéristique – Cytokératine 5/6 + ; EGFR + ; P 53 + • Carcinome canalaire infiltrant de haut grade • Types histologiques spécifiques – Médullaire – BRCA 1/2 associé – Autres: sécrétoire, adénoïde kystique, myoépithélial… • Indications thérapeutiques spécifiques ? Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

Carcinome médullaire RO Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris

0. 6 0. 2 0. 4 Survival rate 0. 5 ER ER + 0. 0 Survival rate 0. 8 1. 0 Taux de survie sans métastase en fonction du statut des RO 0 24 60 120 180 Time (months) Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris 240 300

Analyse histopathologique des cancers du sein Remarques générales Forces Phénotype + immunophénotype à valeur pronostique et prédictive: Robustesse, simplicité, spécificité, coût minime Limites Les cancers triples négatifs, Extension systémique minime: maladie micrométastatique, Nouveaux marqueurs moléculaires pronostiques et prédictifs ? Dr X Sastre-Garau, Institut Curie, Paris