Panorama sulle principali tecniche analitiche Laboratorio di Chimica

Panorama sulle principali tecniche analitiche Laboratorio di Chimica Analitica Ambientale – a. a. 2004 -2005

Valutazione di una tecnica analitica • Accuratezza capacità di determinare il valore vero • Precisione capacità di replicare le misure • Limite di rivelabilità concentrazione minima di analita che può essere rivelata • Range dinamico lineare range di concentrazioni in cui la risposta analitica è lineare Segnale • Sensibilità capacità di distinguere due concentrazioni differenti ma molto vicine Concentrazione • Selettività capacità di distinguere tra due analiti • Effetti matrice effetti di altre componenti del campione sulla risposta analitica

Tecniche analitiche • Tecniche cromatografiche • Tecniche spettroscopiche • Tecniche elettrochimiche • Tecniche volumetriche • Saggi qualitativi

Tecniche cromatografiche • In base alla forma del letto cromatografico • Cromatografia su colonna (impaccata, open-tubular) • Cromatografia planare (su carta, su strato sottile) • In base allo stato fisico della fase mobile • Cromatografia Liquida (LC) • Gascromatografia (GC) • Cromatografia fluida supercritica (SFC) • In base al meccanismo di separazione • Adsorbimento • Ripartizione • Scambio ionico • Esclusione • Affinità

Schema delle tecniche Dalla combinazione dei meccanismi e dei supporti citati, si possono avere numerose varianti di tecniche cromatografiche

Tecniche cromatografiche • analiti volatili o volatilizzabili, termicamente stabili, non ionici Gascromatografia • analiti non volatili o poco volatili, ionici, ionizzabili o non ionici, termicamente instabili Cromatografia liquida • analiti non volatili o termicamente instabili ma non rivelabili dai comuni detector per LC Cromatografia fluida supercritica

Gascromatografia • Gas-liquido • supporto inerte solido • liquido non volatile, legato covalentemente • meccanismo di ripartizione • moltissime applicazioni • Gas-solido • fasi stazionarie di silice, allumina o carbone • meccanismo di adsorbimento • adatta per la separazione di gas permanenti (H 2, He, Ar, O 2, N 2, CO) o idrocarburi a basso punto di ebollizione

Schema di un GC

Colonne per gascromatografia • Colonne impaccate • contengono un supporto solido inerte, finemente suddiviso (comumente basato su terra di diatomee), ricoperto di fase stazionaria liquida • Colonne capillari • WCOT (Wall Coated Open Tubular), strato sottile di fase liquida (1 µm) depositato sulla superficie • SCOT (Support Coated Open Tubular), strato poroso creato sulle pareti della colonna per trattamento o deposizione chimica • PLOT (Porous Layer Open Tubular), strato poroso polimerico o inorganico che funge da fase stazionaria per una cromatografia di adsorbimento

Confronto tra colonne impaccate e capillari Le colonne capillari possono essere lunghe fino a 100 m e hanno quindi un numero di piatti teorici enormemente più elevato rispetto alle colonne impaccate. Questa differenza è esemplificata nella figura a lato (in alto separazione con colonna capillare, in basso la stessa separazione con colonna impaccata)

Rivelatori per GC • a conducibilità termica (TCD) • a ionizzazione di fiamma (FID) • a cattura di elettroni (ECD) • a conducibilità elettrolitica (ELCD) • amperometrico per lo zolfo (ASD) • termoionico (TID o NPD) • fotometrico a fiamma (FPD) • a fotoionizzazione (PID) • ad emissione atomica (AED) • a chemiluminescenza • spettrometria di massa (MS) Uno dei punti di forza della tecnica GC è la grande varietà dei rivelatori disponibili. Alcuni sono aspecifici e quindi di uso generale (TCD, FID), altri sono invece molto specifici (AED, ASD). Quelli universalmente accettati sono TCD ed FID, ma è sempre più diffuso l’impiego del rivelatore a spettrometria di massa Un aspetto da considerare nella scelta del rivelatore è verificare se è distruttivo o no: nel secondo caso può essere interessante mettere in serie più rivelatori (es. TCD e MS)

Rivelatore a conducibilità termica • si misura la variazione di conducibilità termica in un flusso di H 2 ed He • si tratta di un rivelatore non specifico, quindi risponde ad ogni tipo di composto • la sensibilità è una delle peggiori • è un sistema distruttivo non Campione Riferimento

Rivelatore a ionizzazione di fiamma • si misura la conducibilità elettrica di una fiamma in un campo elettrico • è sensibile a tutti i composti contenenti legami C-C e C-H (per questo si tratta del rivelatore più utilizzato) • non risponde a molecole volatili non infiammabili • la sensibilità è buona • è un sistema distruttivo

Rivelatore a cattura di elettroni • si misura la diminuzione di corrente dovuta alla cattura di elettroni da parte di analiti all’uscita della colonna • è sensibile soprattutto a composti con gruppi funzionali elettrofili (alogeni, perossidi, nitrogruppi, ecc. ) • la sorgente di elettroni è un beta-emettitore come 3 H o 63 Ni • la sensibilità è ottima per gli idrocarburi clorurati • è un sistema non distruttivo

Rivelatore a conducibilità elettrolitica • si misura la conducibilità elettrolitica modificata da composti derivati dagli analiti per combustione • è un rivelatore alogenospecifico (pesticidi clorurati, solventi alogenati, PCB, diossine) ma può rivelare anche composti di N ed S • la sensibilità è eccellente per i composti clorurati, ottima per i composti di N ed S • è un sistema distruttivo

Rivelatore amperometrico per S • le sostanze separate sono combuste in atmosfera riducente formando H 2 S che viene rivelato in una cella elettrochimica per ossidazione in-situ • specifico per composti di S • è un sistema distruttivo

Rivelatore termoionico • è specifico per composti contenenti azoto e fosforo (per questo è chiamato anche NPD) • basato sulla formazione di radicali a partire da composti di N e P • è un sistema distruttivo

Rivelatore fotometrico a fiamma • è specifico per composti contenenti zolfo e fosforo • si misura l’emissione ottica a 394 nm per S e 526 nm per P • è un sistema distruttivo

Rivelatore a fotoionizzazione di fiamma • si impiega luce UV per ionizzare gli analiti che escono dalla colonna; gli ioni così prodotti generano una corrente misurata • selettivo per idrocarburi aromatici e composti contenenti eteroatomi (come organozolfo od organofosforo) • è un sistema praticamente non distruttivo, in quanto la frazione di analita ionizzato è bassa

Rivelatore a emissione atomica • rivelatore specifico per elementi, vantaggioso per l’analisi di miscele complesse • basato sull’emissione ottica di atomi formatisi in un plasma di elio a microonde • è un sistema distruttivo

Rivelatore a chemiluminescenza • analogo come principio all’AED, ma la chemiluminescenza è emessa da molecole eccitate piuttosto che da atomi • le bande di luce emessa sono più ampie e più difficili da interpretare • la radiazione di fondo è bassissima, analogamente alla fluorescenza (l’eccitazione è prodotta per via chimica, non spettroscopica) • limitato a composti che possono dare reazioni chemiluminescenti (composti di N ed S soprattutto) • è un sistema distruttivo (l’analita reagisce con un composto)

Rivelatore a spettrometria di massa • accoppiamento ormai più che consolidato e di straordinaria potenza • è l’unico rivelatore che fornisce informazioni strutturali • è un sistema distruttivo

Scelta del rivelatore La selezione è basata su: • natura chimica degli analiti • potenziali interferenze • limite di rivelabilità richiesto • disponibilità e/o costo

Confronto tra rivelatori Rivelatore Target LOD Range lineare TCD non selettivo 1 ng 106 FID idrocarburi 100 pg 107 ECD alogeni 50 fg Cl 104 ELCD composti di N, S, Cl 1 pg 104 - 106 ASD composti di S 10 ppb S 104 NPD composti di N, P 10 pg 104 FPD composti di S, P 100 pg 103 PID idrocarburi aromatici, eterocomposti 2 pg benzene 107 AED elementi 0. 1 – 20 pg/s 104 Chem composti di N, S 10 pg 104 MS specie 10 ng (SCAN), 10 pg (SIM) 105

Cromatografia liquida

Schema di un HPLC

Selezione della tecnica HPLC

Selezione della tecnica IC

Eluizione isocratica o in gradiente isocratica (più forte) isocratica (meno forte) gradiente

Rivelatori per HPLC • Bulk properties: si misura una caratteristica della fase mobile che indirettamente rivela gli analiti • Solute properties: si misura una caratteristica del soluto • Spettrofotometrico UV-visibile (UV-Vis) • UV-visibile con Diode-array (UV-DAD) • Spettrofotometrico IR • Fluorimetrico • Indice di rifrazione (RID) • Elettrochimico (ED) • Spettrometria di massa (MS)

Rivelatore spettrofotometrico UV-visibile • il rivelatore più diffuso (copre più del 70% dei metodi di rivelazione) • basato sull’assorbimento di luce nel range UVvisibile • sensibile a moltissime sostanze organiche ed inorganiche (es. 254 nm) • sensibilità tipica: 0. 1 ppb • è un sistema distruttivo non

Gruppi cromofori Cromoforo Formula max (nm) aldeide -CHO 210 1. 500 amino -NH 2 195 2. 800 azo -N=N- 285 -400 3 -25 bromuro -Br 208 300 carbossile -COOH 200 -210 50 -70 chetone -C=O 195 1. 000 disolfuro -S-S- 194 5. 500 estere -COOR 205 50 etere -O- 185 1. 000 etilene -C=C- 190 6. 000 fenile -C 6 H 5 202, 255 naftile 220, 275 nitrato -ONO 2 270 12 nitrito -ONO 220 -230 1. 000 -2. 000 nitrile -C=N 160 - nitro -NO 2 210 forte

Scelta della lunghezza d’onda La del rivelatore va scelta in base ad alcune considerazioni: • massimizzare sensibilità e specificità • il solvente della fase mobile può causare shifts in max (2 -5 nm) • controllare l’assorbanza degli analiti nella fase mobile • i solventi per fase mobile hanno cutoff nell’UV • operando sotto la cutoff può: • ridurre la sensibilità • introdurre rumore sulla linea di base

Rivelatore Diode-array • misura in ogni istante lo spettro UV-visibile dell’eluato nell’intervallo desiderato • può fornire informazioni strutturali sugli analiti (database di spettri)

Rivelatore spettrofotometrico IR • sensibilità tipica: 1 ppm • applicabilità limitata dall’assorbanza della fase mobile nel range spettrale infrarosso

Rivelatore a fluorescenza • sensibilità 1000 volte superiore rispetto all’assorbimento UVvisibile • sensibilità tipica: 0. 01 ppb • limitato alla rivelazione di composti fluorescenti, ma è possibile la derivatizzazione • è un sistema non distruttivo (tranne che con derivatizzazione)

Rivelatore a indice di rifrazione • basato sulla misura del’indice di rifrazione dell’eluato (tipico rivelatore bulk) • sensibilità tipica: 0. 1 ppm • non adatto con eluizione in gradiente • completamente aspecifico • necessita di termostatazione accuratissima • si usa per composti non attivi nel range UV-visibile (zuccheri) • è un sistema non distruttivo

Rivelatore evaporative light scattering • l’eluato è trasformato in aerosol, desolvatato e mandato in una cella nella quale si misura lo scattering della luce • necessita di fasi mobili volatili • ideale per composti ad alto PM, zuccheri e acidi non volatili • è un sistema distruttivo

Rivelatore elettrochimico • tra i più sensibili (sensibilità tipica: 1 ppt, femtomoli in modalità amperometrica) • possibilità di misura in • voltammetria (per applicazioni particolari) • amperometria • coulometria (raro) • conducimetria (utilizzato in cromatografia ionica) • generalmente poco adatto all’eluizione in gradiente

Rivelatore elettrochimico: amperometria • basata sulla misura della corrente risultante da un’elettrolisi (ossidazione o riduzione) di molecole di analita alla superficie di un elettrodo • il più sensibile tra i rivelatori per LC (fino a femtomoli per alcune applicazioni dopamina) • utilizzabile per tutte le sostanze elettroattive nel range di potenziale dell’elettrodo di lavoro impiegato • possibile avvelenamento degli elettrodi • utilizzo non semplice • è un sistema parzialmente distruttivo

Rivelatore elettrochimico: conducimetria • basato sulla misura della corrente elettrica trasportata da ioni disciolti in un campo elettrico • utile per sostanze ioniche o ionizzabili • rivelatore più comune in cromatografia ionica • sensibilità inferiore rispetto al rivelatore amperometrico • utilizzo molto semplice • è un sistema distruttivo non

Rivelatore a spettrometria di massa • il detector finale: sensibile, selettivo e universale, può permettere la caratterizzazione chimica del campione • possibilità di discriminare analiti coeluiti in modalità SIM • sensibilità tipica: 0. 1 ppb • limitato dall’interfaccia e dalla necessità di rimuovere il solvente dal campione • gli analiti devono essere ionizzabili

Confronto tra rivelatori Rivelatore Target LOD Range lineare UV-visibile/ UV -DAD composti che assorbono luce UV-VIS 1 µg/l 104 Fluorimetrico composti policondensati (PAH) 10 ng/l 103 RID non selettivo 1 mg/l 104 IR 1 mg/l ELSD ED amperometrico composti elettroattivi 100 pg/l ED conducimetrico composti ionici 1 µg/l 103 MS specie 0. 1 µg/l 105

Cromatografia Fluida Supercritica • si utilizza come fase mobile un fluido supercritico (cioè portato al di sopra della temperatura critica, Tc, sopra la quale una sostanza non può più essere trasformata in un liquido), avente caratteristiche fisiche intermedie tra i liquidi e i gas: • maggiore densità rispetto ai gas • minore viscosità rispetto ai liquidi • alto potere solubilizzante • Fluidi supercritici impiegati in cromatografia: • CO 2, Tc = 31°C • C 2 H 6, Tc = 32°C • N 2 O, Tc = 37°C

Caratteristiche della SFC • è utile in particolare per analizzare composti che non possono essere determinati con GC o LC (25% dei problemi analitici): • composti non volatili • composti termicamente instabili • composti non rivelabili con i normali rivelatori per LC • la strumentazione è simile a quelle per GC o LC; necessita controllo accurato della temperatura • fasi mobili analoghe a quelle per HPLC in ripartizione • l’eluato si rivela come gas rivelatori (interfacciamento semplice), TCD, ECD FID, MS

Applicazioni della SFC • separazione di molecole ad alto PM (fino a 105), prodotti naturali, alimenti, additivi, pesticidi, polimeri, esplosivi • CO 2 supercritico può solubilizzare alcani C 5 -C 40 e PAH separazione di polietileni oligomerici con gradiente di pressione

Confronto tra HPLC ed SFC Separazione di bi- e trifenile con HPLC (sx) ed SFC (dx): la velocità di flusso è maggiore in SFC per cui la separazione è più veloce

GC, LC o SFC? • Caratteristiche comuni • Efficienti e altamente selettive; non distruttive (in senso analitico); possono essere quantitative • Vantaggi della GC • Rapida; risoluzione eccezionale; facilmente interfacciabile con MS • Vantaggi della LC • Determinazione di specie non volatili o termicamente instabili, specie ioniche inorganiche • La diffusione longitudinale è trascurabile • Vantaggi della SFC • caratteristiche intermedie tra GC ed LC

Tecniche elettroforetiche Le tecniche elettroforetiche sono spesso associate alle tecniche cromatografiche, in quanto permettono la separazione di miscele di ioni che migrano sotto l’effetto di un campo elettrico con diverse velocità di migrazione. In realtà non si tratta di metodi cromatografici veri e propri, in quanto non avviene la ripartizione degli analiti tra fase mobile e fase stazionaria. Per questo sono chiamate anche tecniche ancillari rispetto alle cromatografiche. La strumentazione richiesta è comunque affine e quindi sono valide molte delle nozioni acquisite in campo cromatografico. La rivelazione delle sostanze avviene mediante colorazione, per via fotometrica o, nell’elettroforesi capillare, con rivelatori più sofisticati come il fotometrico, l’elettrochimico e lo spettrometro di massa Si tratta di un gruppo di tecniche molto utilizzate in campo biologico, biochimico e molecolare per la separazione di proteine, polinucleotidi e altri biopolimeri, e in generale di ioni e anfoliti (sostanze che si comportano come acidi o basi a seconda del p. H, es. aminoacidi e peptidi)

Classificazione delle tecniche Le tecniche elettroforetiche si classificano in: • elettroforesi priva di carrier, in cui gli ioni migrano in una soluzione tampone • elettroforesi mediante carrier, più comunemente utilizzata, in cui gli ioni migrano su un supporto di carta, un gel o un polimero • elettroforesi classica (es. separazione delle proteine del siero) • elettroforesi capillare

Elettroforesi capillare Due grossi svantaggi dell’elettroforesi classica sono: • convezione di calore dovuta alla resistenza del tampone al flusso di corrente elettrica, che porta all’allargamento dei picchi • difficoltà nella valutazione degli elettroferogrammi Questi svantaggi sono superati grazie all’avvento della tecnica capillare, derivata da elementi della GC capillare. In questa tecnica, la migrazione degli ioni avviene in un sistema miniaturizzato, un capillare appunto, nel quale le correnti sono inferiori e conseguentemente il calore di Joule è notevolmente più basso con vantaggi analitici evidenti

Prestazioni dell’elettroforesi capillare La strumentazione necessaria per l’elettroforesi capillare è costituita da due soluzioni tampone, il capillare con dispositivo di raffreddamento, un generatore di energia ad alta tensione, un sistema per l’applicazione del campione e un rivelatore Si utilizzano rivelatori UV, UV-DAD, fluorimetrici, elettrochimici spettrometria di massa e a

Versioni della CE L’elettroforesi capillare comprende una famiglia di tecniche hanno caratteristiche operative e di separazione alquanto diverse. Le tecniche sono: • elettroforesi capillare di zona (CZE): è la forma più semplice di CE, in cui le molecole sono separate in base alle differenze nel rapporto massa/carica • elettroforesi capillare ad alta prestazione (HPCE): evoluzione della CE tradizionale • elettroforesi capillare a gel: è l’adattamento della tecnica tradizionale di elettroforesi su gel operata su un capillare contenente un mezzo anticonvettivo come la poliacrilamide • focusing isoelettrico (IEF): molecole cariche migrano in un campo elettrico nel quale un gradiente di p. H le porta al loro punto isoelettrico • isotacoforesi (ITP): le particelle migrano nel campo elettrico alla stessa velocità • cromatografia capillare elettrocinetica micellare (MECC): l’addizione di sostanze in grado di formare micelle permette la separazione di molecole neutre (es. fenoli)

Vantaggi della CE • utilizza la moderna tecnologia dei rivelatori in modo che gli elettroferogrammi assomigliano molto ai cromatogrammi • l’efficienza è analoga a quella della GC capillare o migliore (N piatti teorici elevatissimo) • richiede una quantità minima di campione e di reagenti • può essere facilmente automatizzata • è applicabile ad un range di analiti più ampio rispetto alle altre tecniche separazione

Selezione della tecnica più adatta Le varie versioni della CE hanno caratteristiche le rendono più adatte in certe situazioni. Nella tabella sono elencate in ordine di efficienza decrescente per la separazione delle diverse classi di analiti Ioni a basso PM Molecole a basso PM Peptidi Proteine Oligo nucleotidi DNA CZE MECC CZE CGE ITP CZE MECC CGE MECC ITP IEF CGE ITP

Applicazioni della CE Dal momento che la stragrande maggioranza delle molecole di interesse biologico è carica, la CE ha applicazioni importanti nell’analisi di aminoacidi, peptidi, proteine, acidi nucleici a altri biopolimeri, con tempi di analisi minori rispetto a tecniche cromatografiche equivalenti (SEC). In particolare, per l’analisi di proteine e peptidi è possibile separare analiti che differiscono per un solo aminoacido. Nella figura è mostrata l’analisi di una soluzione di albumina di siero bovino digerita con tripsina

Applicazioni della CE Altre applicazioni comprendono la separazione di anioni e cationi inorganici e di composti farmaceutici purchè carichi Separazione con MECC di aminoacidi (sx) e di corticosteroidi (dx)

Tecniche spettroscopiche Interazione tra luce e materia Tecniche spettroscopiche • Informazione qualitativa (elementi, composti) • Informazione quantitativa (concentrazione)

Lo spettro elettromagnetico I vari intervalli dello spettro elettromagnetico sono sfruttati a scopo analitico per ottenere informazioni strutturali quali-quantitative sulla materia analizzata Energia

Classificazione delle tecniche spettroscopiche • In base al meccanismo • In base alla specie interessata • assorbimento • atomica • emissione • molecolare • fluorescenza • In base alla regione spettrale impiegata • raggi g (0. 01 Å) PIGE • raggi X (0. 01 Å – 100 Å) XRF, PIXE • UV-Visibile (10 nm – 800 nm) AAS, ICP-AES • IR (800 nm – 0. 4 mm) FT-IR • microonde (0. 4 mm – 0. 25 m) EPR • radiofrequenze (> 0. 25 m) NMR

Assorbimento ed emissione di luce S 1 S 0 A livello microscopico la luce interagisce con la materia in modalità differenti ma sempre legate a salti tra stati energetici L’assorbimento e l’emissione di luce da parte della materia sono interpretabili come passaggio tra due stati di energia di un atomo o una molecola

Spettroscopia atomica e molecolare • Spettroscopia atomica: il campione è trasformato in atomi somministrandogli energia si determinano elementi • Spettroscopia molecolare: il campione è analizzato tal quale si determinano composti

Regioni spettrali utilizzate Irraggiando la materia con la radiazione luminosa si creano effetti diversi a seconda dell’energia della radiazione utilizzata: • raggi g e raggi X provocano transizioni elettroniche nei gusci interni e reazioni nel nucleo • raggi UV e visibile causano transizioni elettroniche nei gusci esterni • raggi infrarossi causano transizioni vibrazionali e rotazionali • microonde e onde radio interessano l’orientazione degli spin elettronici e nucleari

Spettroscopia atomica • Il campione è trasformato in atomi con metodi vari di riscaldamento • Il vapore atomico subisce un interazione con la luce oppure con un campo magnetico; l’entità di questa interazione fornisce la risposta analitica, qualitativa e quantitativa

Tecniche atomiche A seconda del tipo di interazione che subisce il vapore atomico, si possono avere le seguenti tecniche di spettroscopia atomica: • il vapore è irraggiato con una radiazione monocromatica assorbibile solo dagli atomi di un determinato elemento Assorbimento atomico • il vapore subisce un riscaldamento ulteriore e gli atomi emettono il surplus di energia sotto forma di radiazione luminosa Emissione atomica • il vapore subisce un riscaldamento ulteriore e gli atomi si trasformano in ioni i quali sono separati e rivelati con uno spettrometro di massa Spettrometria di massa

Spettroscopia atomica: assorbimento • il campione è trasformato in atomi con metodi vari di riscaldamento • il vapore atomico subisce un’interazione con la luce emessa da una sorgente luminosa (righe) • la riga viene assorbita solo dagli atomi corrispondenti mediante l’assorbimento di risonanza • l’entità di questa interazione fornisce la risposta analitica • qualitativa (quali elementi) • identificazione attraverso le assorbite • quantitativa (qual è la concentrazione) • calibrazione con soluzioni a concentrazione nota • legge di Lambert-Beer (A = b. C)

Spettrofotometria AAS

Assorbimento atomico a fiamma (FAAS) comparto della fiamma regolazione dei gas introduzione del campione combustibile (acetilene) + comburente (aria) fiamma

Assorbimento atomico a fiamma (FAAS) cammino ottico • aspirazione in continuo • segnale dipendente concentrazione e non massa dalla

Atomizzazione elettrotermica (ETAAS) Elettrotermica (ET): atomizzazione mediante una corrente elettrica ad alta potenza che crea un riscaldamento per effetto Joule

Atomizzazione elettrotermica (ETAAS) il campione (poche decine di µl) viene depositato all’interno di un cilindro di grafite detto fornetto, sottoposto poi a cicli di riscaldamento

Fornetti di grafite • Il fornetto di grafite ha dimensioni di pochi cm • La tecnica è nota anche come GF-AAS

Spettroscopia atomica: emissione • il campione è trasformato in atomi con metodi vari di riscaldamento • il vapore atomico emette luce emessa a righe in conseguenza dell’energia somministratta sotto forma di calore • le righe emesse vengono separate e misurate • l’entità dell’emissione fornisce la risposta analitica • qualitativa (quali elementi) • identificazione attraverso le emesse • quantitativa (qual è la concentrazione) • calibrazione con soluzioni a concentrazione nota • intensità propozionale alla concentrazione (I = C)

Spettrofotometria AES

Emissione atomica a fiamma (FF) comparto della fiamma regolazione dei gas introduzione del campione utilizzo lo stesso strumento senza sorgente ottica

Emissione atomica con plasma (ICP-AES)

Spettrofotometria ICP-AES Sistema ottico Torcia di quarzo Smaltimento fumi al PC Nebulizzatore Camera di nebulizzazione 2 canali: 1 per il campione 1 per lo scarico Pompa peristaltica

Spettrometria di massa con plasma (ICP-MS)

Spettrometria ICP-MS

Spettrometria ICP-MS Spettrometro di massa e rivelatore Interfaccia Torcia ICP Introduzione del campione

Caratteristiche tecniche • tecniche distruttive (1500 -8000 °C) • si determinano elementi • si analizzano liquidi, solidi se disciolti • analisi totale del campione • risultati espressi in concentrazione • ottima sensibilità • mg/l per FAAS e FF • µg/l per GFAAS e ICP-AES • ng/l per ICP-MS

Confronto tra tecniche

Limiti di rivelabilità

Spettroscopia molecolare • Il campione è irraggiato con luce avente nell’UV, nel visibile o nell’infrarosso • Le molecole che compongono il campione assorbono l’energia irradiata se essa è in quantità sufficiente per far vibrare i loro gruppi funzionali (visibile, IR) oppure per promuovere transizioni elettroniche (UV, visibile) • La risposta del campione viene registrata e, in base ai segnali raccolti, è possibile risalire alla composizione del campione in termini di molecole • Le tecniche più comunemente utilizzate sono quelle in assorbimento

Spettroscopia molecolare: assorbimento • il campione è irraggiato con luce avente nell’UV, nel visibile o nell’infrarosso (bande o righe) • le molecole che compongono il campione assorbono l’energia irradiata se essa è in quantità sufficiente per far vibrare i loro gruppi funzionali (visibile, IR) oppure per promuovere transizioni elettroniche (UV, visibile) • la risposta del campione viene registrata e, in base ai segnali raccolti, è possibile risalire alla composizione del campione in termini di molecole • l’entità di questa interazione fornisce la risposta analitica • qualitativa (quali composti) • identificazione attraverso le assorbite • quantitativa (qual è la concentrazione) • calibrazione con soluzioni a concentrazione nota • legge di Lambert-Beer (A = b. C)

Spettrofotometria IR Il campione è irraggiato con un intervallo più o meno ampio di ; le assorbite corrispondono ai gruppi funzionali delle molecole, i quali assorbono l’energia equivalente per vibrare. La risposta è visibile sotto forma di spettro di assorbimento Esempio di spettrofotometro IR. Si tratta in genere di strumento molto compatti I campioni liquidi sono analizzati tal quali, mentre per i campioni solidi si prepara una pastiglia di KBr nel quale si disperde il campione polverizzato; è possibile analizzare anche i campioni gassosi

IR: modi di vibrazione Alcuni modi di vibrazione sono gli stretching (allungamenti) e i bending (piegamenti) che corrispondono a livelli energetici ben definiti

Esempio di spettro IR Il campione è irraggiato con un intervallo di compreso tra 2. 5 e 20 µm (o compreso tra 4000 e 500 cm-1). Il 100% della scala di trasmittanza corrisponde ad assorbimento nullo

Spettrofotometria IR Ogni gruppo funzionale ha modi di vibrazione corrispondenti a o ben definite, che ne permettono l’identificazione

Impronta digitale L’insieme dei gruppi funzionali identificati permette di risalire globalmente alla molecola, lo spettro IR della quale corrisponde ad un’impronta digitale

Spettro IR della formaldeide H C H O L’assegnazione delle bande di assorbimento ai vari modi di vibrazione permette di risalire in modo ancora più accurato alla struttura della molecola

Applicazioni IR Esempi di applicazioni della tecnica IR: • caratterizzazione strutturale di prodotti di sintesi • caratterizzazione strutturale di intermedi di sintesi • monitoraggio di cinetiche di reazione • caratterizzazione della purezza di un composto • raramente utilizzata per determinazioni quantitative

Spettrofotometria UV-visibile Il campione è irraggiato con un intervallo più o meno ampio di ; le assorbite, aventi energia sufficiente a promuovere transizioni elettroniche, corrispondono ai gruppi funzionali delle molecole. La risposta è visibile sotto forma di spettro di assorbimento Gli spettrofotometri UV -visibile sono molto diffusi per la loro semplicità di utilizzo e versatilità e per il basso costo; quasi tutte le sostanze organiche presentano assorbimenti nel range strumentale (180 -800 nm) Un utilizzo molto comune si ha come rivelatore per HPLC

Transizioni elettroniche La spettroscopia UV-visibile è detta anche spettroscopia elettronica perchè è basata su transizioni di elettroni tra livelli energetici diversi Le transizioni elettroniche più comuni sono illustrare nella figura sottostante. Esse si verificano se nel campione sono presenti molecole aventi cromofori, cioè gruppi funzionali in grado di assorbire la luce, come il gruppo –NO 2 (nitro), -N 2 - (azo), ecc. Solo le transizioni di elettroni n e hanno energie nel range 200 -800 nm

Esempio di spettro UV-visibile di un’aldeide insatura. La banda a 395 nm rende conto del fatto che il composto è colorato in arancio, colore complementare rispetto al violetto che corrisponde alla regione spettrale interessata (~ 400 nm). Le bande di assorbimento registrate sono in numero minore rispetto all’IR, tuttavia è possibile utilizzarle per effettuare determinazioni quantitative secondo la legge di Lambert-Beer

Tabella dei gruppi cromofori Alcuni esempi di gruppi cromofori con i relativi coefficienti di estinzione molare o assorbività molare ( () Cromoforo Esempio Transizione max (nm) Solvente C=C Etene * 171 15. 000 Esano C =C 1 -Esino * 180 10. 000 Esano Etanale n * * 290 15 180 10. 000 N=O Nitrometano n * * 275 17 200 5. 000 C-X X = Br X=I Metil bromuro Metil ioduro n * 205 200 255 360 C=O Esano Etanolo esano

Applicazioni dell’UV-visibile • caratterizzazione strutturale di prodotti di sintesi • monitoraggio di cinetiche di reazione • caratterizzazione della purezza di un composto o di un prodotto naturale (es. olio, vino) • determinazione quantitativa di specie di interesse chimicoclinico o ambientale (A = b. C) • rivelazione in sistemi cromatografici

Caratteristiche tecniche • tecniche distruttive o non distruttive • si determinano composti • si analizzano liquidi, solidi o gas • analisi totale o parziale del campione • risultati espressi in concentrazione • buona sensibilità (mg/l)

Tecniche molecolari: Raman Il campione è irraggiato con luce monocromatica; le assorbite, aventi energia minore rispetto alla irraggiata, corrispondono ai gruppi funzionali delle molecole, i quali assorbono la differenza di energia per vibrare. A differenza dell’IR, non si misura la luce assorbita ma quella che viene restituita o diffusa dai gruppi funzionali dopo l’assorbimento. La risposta è visibile sotto forma di spettro Spettro Raman di un pigmento

Caratteristiche tecniche • tecniche distruttive o non distruttive • si determinano composti • si analizzano liquidi, solidi o gas • possibili analisi in situ • analisi totale o parziale del campione • risultati espressi in concentrazione • buona sensibilità

Fluorescenza a raggi X Il campione è colpito con un fascio di raggi X dalla sorgente. Gli elementi presenti localmente vengono eccitati, cioè passano ad uno stato energetico superiore, dal quale decadono istantaneamente emettendo radiazioni X monocromatiche specifiche per ogni elemento L’intensità delle radiazioni emesse è correlabile alla concentrazione degli elementi presenti nel campione nel punto irraggiato La zona irraggiata può essere di 3 -100 mm 2

Caratteristiche tecniche • tecnica non distruttiva o distruttiva • si determinano elementi • si analizzano liquidi, solidi • possibilità di analisi in situ • buona risoluzione spaziale • risultati espressi in concentrazione • sensibilità discreta

Altre tecniche spettroscopiche Esistono altre tecniche l’interazione della materia radiazione luminosa di con analisi nelle quali un campo magnetico si e/o sfrutta con una Le tecniche principali in questo settore sono due: • la spettrometria di massa • la risonanza magnetica nucleare o NMR Queste tecniche vengono generalmente considerate tecniche spettroscopiche al pari di quelle descritte in precedenza

Spettrometria di massa (MS) Nella spettrometria di massa le molecole sono trasformate in ioni i quali, attraverso l’interazione con un campo elettromagnetico, sono separati e analizzati per fornire informazioni sul peso molecolare e la struttura della molecola progenitrice

Esempio di spettri MS in questo esempio il campione è costituito da H 2 O. Attraverso la sorgente si possono formare lo ione molecolare (H 2 O + e- H 2 O+ + 2 e-) e i frammenti H+, O+ e OH+ specie massa H 2 O + 18 OH+ 17 O+ 16 H+ 1 I segnali degli ioni sono riportati assegnando allo ione più abbondante il 100% e mostrando gli altri ioni come percentuale di esso

Applicazioni della tecnica MS Le applicazioni della tecnica MS spaziano in tutti i campi della scienza. In particolare: • analisi ambientale (determinazione di composti tossici come diossine, PCB, PAH, ecc. ) • caratterizzazione di composti di interesse biologico o farmaceutico (macromolecole, prodotti di ingegneria genetica, principi attivi, ecc. ) • analisi di materiale di interesse agroalimentare (prodotti naturali e sintetici, ecc. ) • rivelatore per cromatografia, sia GC che LC

Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Questa tecnica analitica è da ormai 50 anni la più utilizzata nel campo della caratterizzazione della struttura di sostanze organiche; ha buone potenzialità anche in campo inorganico Le caratteristiche tecniche dell’NMR ne fanno però uno strumento da ricerca più che da laboratorio, per quanto alcune applicazioni siano entrate nella routine, per esempio nell’ambito del controllo in campo alimentare La tecnica si basa sull’interazione tra atomi aventi numero di spin non nullo posti in un campo magnetico, e una radiazione elettromagnetica nel campo delle radiofrequenze

Nuclei e numeri di spin Alcuni esempi di specie con numero di spin nullo o non nullo sono riportate nella tabella seguente Numero di protoni Numero di neutroni Numero di Spin Esempi NMR-attivo pari 0 12 C, 16 O, 32 S no dispari 1/2 1 H, 19 F, 31 P si dispari 3/2 11 B, 35 Cl, 79 Br si pari dispari 1/2 13 C si pari dispari 3/2 127 I si pari dispari 5/2 17 O si dispari 1 2 H, 14 N no

Schema di uno spettrometro NMR

Chemical shift: esempi

Esempio di spettro 1 H NMR acido dimetilbenzoico

Esempio di spettro 13 C NMR

Tecniche accoppiate Le tecniche accoppiate o ifenate (dall’inglese hyphen che indica il trattino di sillabazione) sono costituite dall’interfacciamento di un sistema separativo ad un sistema di rivelazione spettroscopica Questa combinazione sfrutta i vantaggi di entrambi i sistemi: • la parte cromatografica produce frazioni pure di analita • la parte spettrale fornisce informazioni su un componente puro Le tecniche ifenate più comuni sono GC-MS ed LC-MS, disponibili in versioni commerciali largamente diffuse. Altre tecniche sono meno diffuse, es. GC-AES, LC-ICPMS. A parte GC-MS, si tratta normalmente di strumenti disponibili a grandi centri di ricerca

Informazioni fornite Le grandi potenzialità delle tecniche ifenate sono legate alle informazioni strutturali che forniscono sul campione • spettri di massa • determinazione di specie diverse di uno stesso elemento

Determinazione di metalli Combinazioni possibili • step di cleanup della matrice • step di preconcentrazione • possibilità di studi di speciazione

Criteri di scelta: separazione Scelta della fase mobile o del carrier rivelatore gassoso secco acquoso organico salino AFS +++ X X X FAAS ++ ++ ICP-AES ++ ++ ICP-MS ++ ++ + X • carrier gassoso (solo per elementi che formano idruri) • GC-AFS • IEC-(postcolumn-HG)-AFS • carrier organico (specie lipofiliche) • RP-HPLC-FAAS • RP-HPLC-ICP-AES (necessaria desolvatazione) • RP-HPLC-ICP-MS (necessaria desolvatazione) • tamponi (specie ioniche e non ioniche) • IEC-ICP-MS (solo tamponi < 50 m. M) • Ion pair-RP-HPLC-ICP-AES +++ necessario ++ possibile + in condizioni specifiche X non utilizzabile

Criteri di scelta: rivelazione • in base agli analiti da determinare • As, Se, Hg, Sb AFS • Cu, Zn, Cr FAAS • in base alla concentrazione • elementi maggiori FAAS • tracce AFS, ICP-AES • ultratracce AFS, ICP-MS • il rivelatore deve poter funzionare in modalità continua • il sistema deve generare segnali transienti

Speciazione di elementi volatili Se, As, Sb, Te, Hg, (Sn) formano idruri volatili LC-HG-AFS Separazione di composti organoarsenici

GC-ICP-MS • solo per elementi che formano composti volatili • necessita di derivatizzazione (HG o etilazione) • 100 % di campione introdotto nel detector (sensibilità elevata) • nessun problema di interfaccia (carrier gassoso!)

Speciazione di organometalli Speciazione di composti organostannici (5 ppb)

GC-ICP-AES • meno sensibile di GC-ICPMS • interfacciamento semplice • produce uno spettro di emissione per ogni analita

GC-FTIR • può distinguere isomeri strutturali che presentano lo stesso spettro di massa • fornisce informazioni sulla struttura molecolare anche in assenza di un esatto riferimento • limitazione: librerie povere (poche migliaia di spettri contro 250. 000 spettri in MS), in quanto la maggior parte degli spettri è in fase liquida o solida, ma in fase gas sono diversi

CE-ICP-MS • richiede un’interfaccia speciale • effetti matrice elevati • consumo di campione bassissimo (n. L) • risoluzione eccellente

Tecniche elettrochimiche Le tecniche elettrochimiche sono rivolte alla determinazione di specie elettroattive. Si tratta di un gruppo di tecniche con ottime prestazioni in termini di sensibilità, versatilità e rapporto qualità/costo, ma sono solitamente poste in secondo piano a causa della difficoltà di comprendere appieno la teoria che sta alle loro basi

Classificazione

Tecniche volumetriche

Saggi qualititativi