p 53 ALTERACIONES CROMOSOMICAS TABAQUISMO Y ARSNICO EN

p 53, ALTERACIONES CROMOSOMICAS, TABAQUISMO Y ARSÉNICO EN CÁNCER DE VEJIGA

Rey, Omar Sambuelli Ruben Guidi, Andrés Gómez Silvia Moore, Lee Smith, Allan

Introducción: Estudios previos demostraron que tabaquismo y exposición al arsénico en el agua de beber son factores de riesgo para cáncer de vejiga.

ØLa exposición al arsénico inorgánico como agente cancerígeno está demostrada en varios cánceres humanos, incluído el urotelial vesical y es un grave problema de salud pública.

ØEl mecanismo y dosis a los cuales el As provoca cáncer no está bien claro.

Ø No hay datos que comparen genéticamente los cánceres relacionados con el arsénico respecto a los no relacionados. Ø Estudios genéticos comparando tumores de individuos expuestos y no expuestos al As pueden proveer datos sobre el mecanismo de estos cánceres inducidos químicamente.

ØLa MUTACION DEL GEN de p 53 se cree que es un mecanismo clave de la inactivación genética.

Øp 53 está frecuentemente mutada en casi todos los tipos de cánceres humanos.

ØLa inactivación del gen supresor tumoral p 53 se observa en muchos tumores malignos humanos incluyendo el cáncer de vejiga.

El estudio fue dirigido a comparar las mutaciones de p 53 en tumores vesicales en pacientes de una zona de hidroarsenicismo crónico regional endémico (HACRE).

Øp 53 es excelente biomarcador para estudio de prevalencia, tipo y localización de mutaciones en tumores.

ØLa proteína normal p 53 actúa en la regulación del ciclo celular, mantención de la estabilidad genómica y en la apoptosis.

ØMayoría de las mutaciones inactivantes de p 53 consisten en mutaciones puntuales en dominios que llevan a cambios en la composición de los aminoácidos de la proteína p 53.

ØEl estudio de los patrones de cambios moleculares en el gen p 53 en tejidos de tumores puede proveer claves para conocer el mecanismo de formación tumoral y de los eventos carcinogénicos iniciales.

ØTipos específicos de canceres están asociados con mutaciones características.

ØHay algunas evidencias de un espectro mutacional específico de p 53 asociado a exposiciones a determinados carcinógenos.

ØMecanismos mutacionales endógenos y exógenos pueden mostrar distintos patrones mutacionales de p 53.

ØMutación en sitios Cp. G indican compromiso de diversos agentes exógenos. ØSe han sugerido como loci frecuentes de daño del ADN por agentes carcinógenos exógenos las bases de citosina en sitios metilados Cp. G.

ØCarcinógenos como tabaquismo y cloruro de vinilo causan primariamente transversiones G: C a C: G, y A: T a T: A respectivamente.

ØEl gen p 53 se halla mutado en casi 40% de tumores vesicales.

ØCon IHQ pueden detectarse mutaciones de p 53 ya que una p 53 mutada posee mayor vida media detectable con el Ac.

ØErrores potenciales de la IHQ : puede haber mutaciones fuera de los exones examinados con sitios promotores extragénicos que llevan a expresión génica reducida o pueden resultar en codones de paro que interrumpen la traslación.

ØP 53 también puede ser transcripcionalmente sub o sobre-expresada determinado falsa negatividad o positividad con la IHQ.

Ø 18% de las mutaciones- inserciones y delecciones- halladas en tumores vesicales resultan de un cambio G: C a A: T en el sitio de los dinucleótidos Cp. G Ø Las mutaciones en sitios Cp. G son vía deaminación de 5´metilcitosina a timidina.

Material y métodos Se compararon tumores de vejiga de 105 pacientes fumadores y no fumadores expuestos a diversos niveles de As en el agua de beber en una zona de HACRE agrupándolos en 4 categorías basadas en la concentración media de As en el agua de beber conforme registros oficiales de un periodo entre 5 y 40 años previos al diagnóstico de cáncer vesical

Material y métodos Exposición al As: midiendo concentración de As en agua en casa del paciente y residencias previas basándose en registros oficiales en los 5 años con mayor concentración de Asbasados en registros oficiales de un periodo entre 5 y 40 años previos al diagnóstico del Carcinoma urotelial. En caso de pozos privados se investigó el actual y anteriores, y en caso de cerrado el más próximo a similar profundidad.

Material y métodos G 1 (0 a < 10 μg/L) G 2 (10 -99 μg/L), G 3 (100 - 299 μg/L), G 4 (> 300 μg/L).

Material y métodos Las alteraciones de p 53 se estudiaron con IHQ y métodos de secuenciación para estudio de mutaciones. Se confrontaron las mutaciones de p 53 con el estadio, grado, género e historia o no de tabaquismo.

Material y métodos Casos nuevos diagnósticados de Ca vesical a células transcicionales entre 1996 y 2000 en pacientes residentes en departamentos Unión y Marcos Juarez de Córdoba (población 193000 hab)Area seleccionada por alta concentración de As en el agua y alta mortalidad por Cancer vesical

Material y métodos En pacientes se chequeo tiempo de residencia, hábitos actuales y pasados de consumo de aguas, hábitos tabáquicos si los había, e historia ocupacional.

Material y métodos • 4 grupos Cada grupo estratificado por • • estadio y grado conforme OMS género y hábito tabáquico

Material y métodos • Microdisección de cortes de parafina de 5 μm, seleccionado el área de tejido menos “contaminada” con células normales no tumorales y representativa de la lesión. • Tamaño mínimo requerido: 0. 3 mm 2 (aprox. 500 céls) • Aislamiento del ADN y amplificación por PCR

Material y métodos • IHQ con Ac para p 53 – con recuperacion antigénica. • Interpretación positiva: patrón de tinción finamente granular sólo nuclear. Estimación del número de células positivas y negativas.

Material y métodos • Se consideró negativa : ninguna célula teñida. • Se consideró como ”< 10%”: entre 1 célula y menos del 10% de células marcadas. • Se consideraron positivas marcaciones de al menos 10% de las células.

Material y métodos • Secuenciación: Secuenciación en la secuenciación fluorescente se usó Big. Dye TM de PE Biosystems, luego se purificó con kitt de Amersham Pharmacia Biotech para remover exceso de primers y nucleótidos. • Primero se secuenciaron los exones en sentido “forward”- Si se sospechaba una mutación se secuenciaba para confirmar en sentido reverso con reacción de PCR independiente.

Material y métodos • Se investigó también frecuencia y tipo de cambios cromosómicos comparando ADN extraído de tumores vesicales de pacientes expuestos y no expuestos al As

Material y métodos Para definir aberraciones genéticas del genoma: Ø Técnicas de hibridación genómica comparativa (HGC) sobre ADN extraído de muestras de tumores incluidos en parafina Ø En la HGC, las copias anormales de ADN se detectan por hibridizaciones simultáneas del tumor y ADN de metafases normales.

ANÁLISIS ESTADÍSTICOS • Test del chi- cuadrado X 2 sobre tablas de análisis de contingencia para verificar variaciones en mutación y frecuencia de tinción para cada categoría de variables (género, hábito tabáquico y arsenicismo) • La proporción de casos con mutaciones o IHQ positiva se calculó dividiendo el número de casos anormales totales por el número de tumores en el grupo.

ANÁLISIS ESTADÍSTICOS • Con software Stata 6. 0 se calculó OR e intervalos de confidencia (CI 95%). • Cálculo de transciciones y transversiones dividiendo el número de tumores con una mutación dada por el número total de tumores con mutaciones

GRUPOS • ESTADIO Nº % TOTAL ESTADIO Ta T 1 T 2 -T 4 105 (100) 31(30) 40(38) 34(32)

GRUPOS • GRADO Nº % TOTAL GRADO 1 2 3 105 (100) 31(30) 51(49) 21(22)

GRUPOS GENERO( p< 0. 01) Masculino 90 (86%) Femenino 15 (14 %)

HABITO TABAQUICO Total Siempre Nunca Nº % 84 (80) 21 (20)

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR ESTADIO TOTAL ESTADIO Ta T 1 T 2 -T 4 p (tend) <0. 001 CAMBIOS GANANCIAS PERDIDAS 5. 1 + 6. 1 5. 6 + 4. 9 9. 8+ 6 -3 <0. 001 2. 4 + 3. 5 2. 4 + 2. 7 4. 8 + 3. 5 <0. 001 2. 7+ 3. 1 3. 2 + 2. 7 5. 3+3. 4

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR GRADO 1 2 3 p (tend) CAMBIOS GANANCIAS PERDIDAS 2. 6+2. 6 7. 9+6. 2 9. 5+6. 4 <0. 001 0. 8+1. 2 3. 5+3. 4 4. 9+3. 5 < 0. 001 1. 8+1. 7 4. 4+3. 3 4. 6+3. 4 <0. 001

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR GENERO Masculino Femenino p CAMBIOS GANANCIAS PERDIDAS 6. 7+6. 1 6. 6+6. 4 0. 89 3. 0+3. 3 2. 9+3. 3 0. 84 3. 7+3. 1 3. 2+ 3. 3 0. 91

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR HABITO TABAQUICO CAMBIOS GANANCIAS PERDIDAS HABITO TABAQUICO Siempre Nunca p 6. 9+6. 0 6. 1+6. 4 0. 51 3. 1+3. 3 2. 9+3. 3 0. 73 3. 8+3. 1 3. 2+3. 3 0. 37

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR CATEGORIA DE EXPOSICION EXPOS. 1 2 3 4 p CAMBIOS m+ Ds 5. 7+5. 1 5. 6+5. 1 7. 3+7. 4 9. 1+6. 5 0. 03 GANANC. m + DS 2. 4+2. 7 2. 4+2. 9 3. 8+4. 1+4. 0 0. 03 p 0. 02 0. 008 (tend. ajust. grado y estadio) PERDID. m+ DS 3. 3+2. 9 3. 3+2. 8 3. 6+3. 4 5. 1+3. 4 0. 06 0. 05

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR CATEGORIA DE EXPOSICION Categoria de Exposición Bajo grado(1) 1 cambios Ta 3. 3+4. 9 T 1 3. 6+2. 5 T 2 -4 0 Total 3. 5+3. 1 2 cambios 1. 2+1. 1 0. 7+1. 2 2. 0 1. 1+1. 1 3 cambios 3. 3+3. 3 2. 1+2. 1 0 2. 5+2. 5 4 p cambios 3. 0+3. 6 0. 67 2. 0 0. 42 7. 0 3. 6+3. 2 0. 79

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR CATEGORIA DE EXPOSICION Categoria de Exposición Alto grado(2 -3) 1 cambios Ta T 1 T 2 -4 Total 3. 6+3. 5 7. 0+5. 1 7. 6+6. 4 6. 3+5. 5 2 cambios 9. 0+2. 7 6. 6+5. 0 9. 8+5. 4 8. 3+4. 7 3 cambios 9. 3+11. 9 5. 7+3. 6 14. 3+6. 5 10. 3+7. 8 4 cambios p 13. 3+11 0. 07 9. 7+6. 3 0. 42 10. 1+5. 5 0. 11 10. 5+6. 4 0. 01

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR CATEGORIA DE EXPOSICION Y HABITO TABAQUICO Categoria de Exposición 1 2 3 4 p p ajustada FUMADORES CAMBIOS 6. 3+5. 3 5. 7+5. 2 7. 1+7. 1 9. 9+ 6. 0 0. 11 0. 03 GANANCIAS 3. 7+2. 8 2. 4+3. 0 3. 6+4. 1 4. 3+3. 2 0. 16 0. 02 PERDIDAS 3. 6+3. 0 3. 3+2. 8 3. 5+3. 2 5. 7+3. 2 0. 10 0. 06

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR CATEGORIA DE EXPOSICION Y HABITO TABAQUICO Categoria de Exposición 1 2 3 4 p p ajustada NO FUMADORES CAMBIOS 3. 8+4. 1 5. 3+5. 3 8. 9+9. 8 7. 9+7. 3 0. 08 0. 15 GANANCIAS 1. 6+2. 1 2. 5+2. 6 4. 8+4. 7 3. 8+5. 8 0. 04 0. 07 PERDIDAS 2. 4+2. 3 2. 8+2. 8 4. 0+5. 4 4. 1+3. 7 0. 25 0. 52

El porcentaje de mutaciones halladas fue más alto en fumadores que en no fumadores y sólo en los fumadores se hallaron los pocos tumores con mutaciones dobles.

La relación con el tabaquismo fue débil, 38% de mutaciones de p 53 en fumadores y 27% en no fumadores (p=0. 34)

TENDENCIAS EN ALTERACIONES CROMOSÓMICAS ESPECÍFICAS CON ESTADIO, GRADO, HÁBITO DE FUMAR Y EXPOSICIÓN AL ARSENICO GANANCIAS 3 q 5 p 6 p 7 p 10 p 8 q 11 q 0. 04(0. 03) 17 q 19 q 20 q p (p>0. 1) 0. 01 ------ 0. 04 (p. aj-0. 03) 0. 04 0. 03 ----0. 03 0. 006 0. 003 0. 002 0. 04 0. 01 ----0. 02 -----------0. 03 ------------- 0. 004 ------ 0. 006 0. 05 0. 03 -------

TENDENCIAS EN ALTERACIONES CROMOSÓMICAS ESPECÍFICAS CON ESTADIO, GRADO, HÁBITO DE FUMAR Y EXPOSICIÓN AL ARSENICO PERDIDAS 8 p 11 p 17 p 5 q 9 q 18 q Y 0. 0001 0. 03 -----0. 0001 0. 002 -----0. 03 ---0. 00001 -------0. 05 ------ 0. 06 ----0. 04 0. 08 ------ 0. 07 (0. 05) ----0. 03(0. 03) -----

Los tipos más frecuentes de mutaciones fueron sustituciones de una sola base (transciciones y transversiones)

El porcentaje de tumores conteniendo transiciones aumentó con el estadio tumoral (tend p= 0. 005) y el grado (p= 0. 004), pero no fue evidente con las pocas transversiones halladas.

TRANSICIONES TOTAL 81% ESTADIO Ta 62% T 1 85% T 2 -4 84% p tendencia TRANSVERSIONES 19% 38% 15% 16% 0. 29

TRANSICIONES TOTAL 81% GRADO 1 75% 2 83% 3 80% p tendencia TRANSVERSIONES 19% 25% 17% 20% 0. 99

TRANSICIONES TOTAL 81% TABACO Siempre 85% Nunca 57% p tendencia TRANSVERSIONES 19% 15% 43% 0. 08

TRANSICIONES G a A en sitios Cp. G TOTAL GRADO 1 2 3 Tend. p (a) 24. 6% 10. 7% 24. 6% 36. 4% 0. 02 (b) 14. 2% (c) 40% 10. 7% 13. 9% 18. 2% 0. 40 75% 37. 5% 35. 2% 0. 28 (a): Transición G a A (b): Transición G a A en sitios Cp. G (c): % de mutaciones G a A en sitios Cp. G / Total de mutaciones

TRANSICIONES G a A en sitios Cp. G TOTAL ESTADIO Ta T 1 T 2 -4 Tend. p (a) 24. 6% 11. 4% 27. 5% 32. 5% 0. 04 (b) 14. 2% (c) 40% 11. 45% 50% 13. 7% 41. 2% 17. 5% 35% 0. 45 0. 46 (a): Transición G a A (b): Transición G a A en sitios Cp. G (c): % de mutaciones G a A en sitios Cp. G / Total de mutaciones

TRANSICIONES G a A en sitios Cp. G TOTAL TABACO Siempre Nunca Tend. p (a) 24. 6% 28. 0% 11. 5% 0. 08 (b) 14. 2% 17. 0% 3. 8% 0. 11 (c) 40% 44. 7% 14. 3% 0. 16 (a): Transición G a A (b): Transición G a A en sitios Cp. G (c): % de mutaciones G a A en sitios Cp. G / Total de mutaciones

TRANSICIONES G a A en sitios Cp. G TOTAL ARSENICO 1 2 3 4 Tend. p (a) 24. 6% 16. 3% 25. 0% 42. 9% 16. 0% 0. 26 (b) 14. 2% (c) 40% 14. 3% 25. 0% 0. 39 50. 0% 40. 0% 53. 3% 0. 0% 0. 22 (a): Transición G a A (b): Transición G a A en sitios Cp. G (c): % de mutaciones G a A en sitios Cp. G / Total de mutaciones

ARSENICO EN NO FUMADORES SOLAMENTE 1 2 3 4 Tend. p (a) (b) 20. 6% 29. 2% 48. 0% 17. 7% 0. 45 17. 6% 16. 7% 24. 0% 0. 40 (c) 54. 5% 40. 0% 70. 0% 0. 20 (a): Transición G a A (b): Transición G a A en sitios Cp. G (c): % de mutaciones G a A en sitios Cp. G / Total de mutaciones

La prevalencia de tumores con mutaciones transcicionales aumentó con el grado y el estadio, siendo mayor en fumadores. Se halló el codón 273 con mutación en el 11% de tumores de fumadores.

MUTACIONES DE p 53 e IHQ y EXPOSICIÓN AL ARSÉNICO IHQ p 53+ CASOS % Exposición 1 34 2 42 3 46 4 47 p (tendencia) OR 95% IC OR ajust 95% IC 1. 0 1. 4 (0. 8 -3. 5) 1. 63 (0. 7 -4. 0) 1. 69 (0. 7 -4. 3) 0. 21 1. 0 1. 57 (0. 6 -4. 2) 1. 91 (0. 8 -4. 9) 1. 74 (0. 6 -4. 7) 0. 18

MUTACIONES DE p 53 y EXPOSICIÓN AL ARSÉNICO MUTACIONES CASOS Exposición 1 28 OR 95% IC OR ajus 95% IC 1. 0 36 1. 44 1. 77 3 46 (0. 5 -4. 0) 2. 24 (0. 8 -6. 1) (0. 9 -7. 6 2. 61 (0. 9 -4. 8 4 36 1. 45 (0. 5 -4. 2) 1. 53 (0. 5 -4. 7 2 p (tendencia) 0. 28 0. 24

CONCLUSIONES • Los tumores de vejiga asociados con más altos niveles de exposición al As muestran aumento de la inestabilidad cromosómica

CONCLUSIONES ØEl número de aberraciones cromosómicas se incrementa con el estadio tumoral y el grado (p>0. 001), independiente de la exposición al As, pero NO se asoció con historia de tabaquismo

CONCLUSIONES Ø La mayoría de los cambios cromosómicos específicos que se relacionan con el As estuvieron asociados también con el estadio y el grado de los tumores, lo que sugiere que posiblemente la exposición al Arsénico podría determinar mayor agresividad en los carcinomas de células transcicionales.

CONCLUSIONES La mutación de p 53 en tumores vesicales aumentaron con el estadio y el grado tumoral, pero no con el grado de exposición al As.

CONCLUSIONES La exposición al As en el agua de beber no es fuerte inductora de mutaciones en p 53.

CONCLUSIONES La inestabilidad genética asociada con la exposición al As en tumores vesicales probablemente ocurre por un mecanismo independiente de p 53.