Oxid dusnat NO vaclav hampllf 2 cuni cz

Oxid dusnatý (. N=O) vaclav. hampl@lf 2. cuni. cz

http: //fyziologie. lf 2. cuni. cz

Proč přednáška o NO? • 1985: znečištění vzduchu (smog, kyselý déšť) • dnes: nejstudovanější endogenní molekula dekády

Explozivní rozvoj znalostí o NO Učebnice to špatně stíhají

Proč ještě je NO zajímavé? • Účastní se funkce všech hlavních orgánových systémů • Během pár let od základního objevu k fundamentálním pokrokům klinické praxe

Z historie: 1620 První příprava NO: Jan Baptista van Helmont Cu + HNO 3 -> Cu 2+ + NO + H 2 O (t. j. dříve než třeba kyslík - 1774)

1772 Chemická charakterizace: Joseph Priestley (objevitel kyslíku)

1800 Toxicita: Sir Humphry Davy (málem umřel, když se toho nadýchal)

1867 Amylnitrit snižuje krevní tlak při hypertenzi (dnes víme, že to dělá tím, že uvolňuje NO)

1914 -1918 • Plnění nitroglycerinu do granátů -> nízký krevní tlak • Proto nitroglycerinové tablety proti angině pectoris (dnes víme, že to dělá tím, že uvolňuje NO)

1977 NO aktivuje guanylát cyklázu a tak zvyšuje intracelulární koncentraci c. GMP: Ferid Murad

1980 Endoteliální relaxační faktor (EDRF): Robert Furchgott

1987 Eukaryotické buňky umí tvořit NO: Louis Ignarro, Salvador Moncada

1998 Nobelova cena za fysiologii a lékařství “Za klíčové objevy týkající se NO jako signální molekuly v kardiovaskulárním systému"

Chemie NO • NO je plyn (kapalní při -152 o. C, tuhne při -164 o. C) • NO je radikál + tj. lichý počet valenčních elektronů + má jich 11 (N 2 má 10; O 2 má 12) • Z N 2 a O 2 vzniká jen za zvláštních podmínek (např. blesk) • Taky spalovací motory, elektrárny

Rozpustnost NO • Málo rozpustný ve vodě + ~1. 7 mmol/l při 25 o. C + t. j. podobně jako O 2 či N 2 • Lipofilita -> snadný průchod membránami

Autooxidace NO • V přítomnosti O 2: 2 NO + O 2 --> 2 NO 2 • NO 2 je jedovatý radikál • Rychlá (několik sec), je-li NO i O 2 hodně • Pomalá, je-li NO málo + to je většinou v tkáních (NO < 10 M)

Autooxidace NO • ~ 200 x rychlejší v roztoku než v plynné fázi • V roztoku jsou produktem autooxidace nitrity (NO 2 -) • Pouze v přítomnosti hemoproteinů proběhne oxidace až na nitráty (NO 3 -)

Reakce se superoxidem • O 2 - je reaktivní kyslíkový radikál + vzniká trochu v respiračním řetězci + hodně v místech zánětu (NADPH oxidáza) • S NO tvoří extrémně rychle peroxynitrit: NO + O 2 - --> OONO • OONO- není radikál, ale je vysoce reaktivní (víc než O 2 -) a cytotoxický (taky nitrosyluje) a v biol. systémech déle vydrží

Inaktivace NO hemoglobinem • Velká afinita NO k hemu • Rychlá inaktivace NO oxidací s Fe oxyhemoglobinu za vzniku NO 3 nitroso. Hb --> met. Hb --> Hb reduktáza --> oxy. Hb

Biosyntéza NO • Pětielektronová oxidace terminálního guanidino dusíku L-argininu molekulárním kyslíkem: L-arg + O 2 --> NO + L-cit • Stereospecificita • Celou reakci katalyzuje jediný enzym, NO syntáza (NOS)

NO syntázy • 3 izoformy: I, III + obsahují v aktivním centru hem + aktivní jako homodimery + nutné kofaktory: • • • NADPH 6(R)-5, 6, 7, 8 -tetrahydrobiopterin FAD FMN kalmodulin

Aktivita NOS 2+ Ca Ca 2+ BH 4 NH 2 - FMN - COOH Hem CAM COOH FAD FMN FAD - NH 2 BH 4

Aktivita NOS L-Arginin + O 2 Ca 2+ NO + L-Citrulin N -OH-L-Arg NADP+ + H+ BH 4 FMN NH 2 - COOH - Hem FAD CAM Hem - NH 2 FMN BH 4 NADPH NADP+ + H+ FAD e - - COOH CAM e- NADPH N -OH-L-Arg Dimerizace NO + L-Citrulin L-Arginin + O 2

NOS I • n. NOS (neuronální) • ~160 k. Da • Gen na lidském chromosomu 12 • Vyžaduje Ca 2+ (nutné pro vazbu kalmodulinu) • Rozpuštěná v cytosolu

NOS I • Konstitutivně exprimována: + centrální a periferní neurony + některý epitel, cévní hladký sval + kosterní sval • Regulace aktivity: + Ca 2+ + ser/tyr fosforylace + NO (zpětnovazební inhibice)

NOS I Hlavní uplatnění: + neurotransmise + neuromodulace

NOS II • i. NOS (inducibilní) • ~130 k. Da • Gen na lidském chromosomu 17 • Nepotřebuje Ca 2+ (váže kalmodulin trvale i bez Ca 2+) • Rozpuštěná v cytosolu

NOS II • Exprese je inducibilní (cytokiny. . . ): + makrofágy + glie, hepatocyty + endotel, epitel + srdeční myocyty, hladký sval, … • Regulace aktivity: + indukce exprese + NO (zpětnovazební inhibice)

NOS II Hlavní uplatnění: + boj s infekcí + zabíjení nádorových buněk

NOS III • e. NOS (endoteliální) • ~133 k. Da • Gen na lidském chromosomu 7 • Vyžaduje Ca 2+ (nutné pro vazbu kalmodulinu) • Vázaná na buněčnou membránu (kaveoly)

NOS III • Konstitutivně exprimována: + endotel + plicní a renální epitel; trombocyty + srdeční myocyty + hipokampus • Regulace aktivity: + Ca 2+ + ser/tyr fosforylace + modulace exprese

NOS III Hlavní uplatnění: +regulace cévního tonu +regulace krevního zásobení orgánů

Mitochondriální NOS • Podobná NOS I • Nejasný význam

Účinky NO na cílovou tkáň 1. Cytotoxicita: + při vysoké koncentraci (i. NOS) + poškození bílkovin, DNA, lipidů + oxidace (O 2, O 2 -) —> reaktivní, toxické produkty (NO 2, ONOO-) + inhibice respirace + boj s infekcí a tumory

Účinky NO na cílovou tkáň 2. Prostřednictvím c. GMP: + Při nižších koncentracích (e. NOS, n. NOS) Oxidace jen pomalá + Převládá vazba NO na hem solubilní isoformy guanylátcyklázy + cyklický guanosin-3', 5‘ monofosfát (c. GMP) + c. GMP aktivuje c. GMPdependentní protein kinázu (G-kinázu)

solubilní isoforma (typ I) – Mechismus NO-c. GMP

Další osud c. GMP Inaktivace c. GMP: Fosfodiesterázy cyklických nukleotidů + zejména typ V. + vzniká 5'-GMP

Farmakologie NO • Donory NO (nitroglycerin, nitroprusid, NOáty) • Inhibitory NOS (L-NMMA, L-NAME, aminoguadinin, ADMA) • Aktivátory e. NOS (endotel-dependentní vazodilatancia) • Inhibitory fosfodiesterázy (Sildenafil, Zaprinast)

Funkce NO: Neurotransmise • Difusní modulace • NANC • Retrográdní messenger (zpětné potvrzení příjmu zprávy) • Dlouhodobá potenciace (presynaptická buňka příště vyšle silnější signál podklad paměti) • Učení, paměť, spánek, bolest, deprese

Funkce NO: Cytotoxicita Boj s infekcí a tumory: + baktérie (i jinak obtížně zlikvidovatelné, např. Mycobacterium tuberculosis) + + houby parasiti tumory inhibice replikace virů

NO v dechu Nejvíc NOS je v nose a paranasálních dutinách • Dezinfekce ? • Regulace plicních cév ? • Mění se při některých nemocech (astma) NO v dechu (ppm)

Vazodilatace závislá na endotelu s endotelem + L-NAME bez endotelu s endotelem

Vazodilatace závislá na endotelu Acetylcholin Endotel M 1 M 3 NO Hladký sval Relaxace Cholinesteráza

Vazodilatace závislá na endotelu Acetylcholin Endotel M 1 M 3 NO Acetylcholin M 3 Hladký sval Kontrakce Relaxace

Vazodilatace závislá na endotelu Potencují ji: + estrogeny • ženy před menopauzou riziko kardiovaskulárních chorob • po menopauze doženou muže + insulin • nabídka glukózy tkáním díky prokrvení

Funkce NO: regulace cév Průtokem indukovaná vazodilatace: vazodilatace v periferních orgánech -> rychlost proudu krve v proximálnějších cévách -> střižné napětí (shear stress) -> aktivita (a exprese) e. NOS -> vazodilatace proximálnějších cév NO je v tomto nenahraditelný (porucha vede k hypertenzi)

„Tonická“ tvorba NO Střední arteriální tlak (mm. Hg)

Endogenní inhibitory NOS • Asymetrický dimethylarginin (ADMA) • NG-monomethyl-L-arginin (L-NMMA) ADMA -> riziko atherosklerózy

Průtok krve plícemi při narození

NO a termoregulace

NO v ledvinách Zprostředkuje tlakovou diurézu: arteriální tlak -> mechanické namáhání endotelu -> syntéza NO -> difuse k proximálním tubulům -> reabsorbce Na+

NO a erekce NO z terminál n. pelvici relaxuje kavernózní hladký sval

NO u samic El. stimulace

Funkce NO • Snižuje srážlivost krve + Inhibice adhese, agregace a sekrece trombocytů + Aktivované trombocyty také tvoří NO zpětnovazební inhibice agregace Fylogeneticky staré - krabi před 500 milióny let (hodně dlouho před savci)

NO inhibuje apoptózu • Apoptóza: "fysiologický" způsob smrti • Na rozdíl od nekrózy nepůsobí zánět • NO (->c. GMP -> G kináza) inhibuje apoptotické fosforylační signály • NO přímo inhibuje kaspázy (specifické proteázy apoptózy)

Další funkce NO • NO z endokardu moduluje srdeční kontraktilitu • Tlumí kontrakci kosterního svalu • Esenciální negativní regulátor proliferace při vývoji (bez zastavení růstu není diferenciace) • Kost: + Hodně NO (např. estrogenem, namáháním - NOS I): • inhibice resorpce (inhibicí tvorby a aktivity osteoklastů) + Málo NO: • potenciace resorpce indukované cytokiny • asi esenciální pro normální funkci osteoklastů • Podíl na regulaci laktace (? )

Patofysiologie NO + + + + septický šok hypertenze (? ) atheroskleróza angina pectoris záněty erektilní dysfunkce diabetes mellitus (? ) mozková mrtvice, roztroušená skleróza, Alzheimer (? ), Parkinson (? )

Septický šok • Infekce (endotoxin) indukuje expresi i. NOS • Vysoká tvorba NO: + likvidace infekce + ale i vazodilatace -> masivní hypotenze

NO a hypertenze • e. NOS -> hypertenze Ale: • syntéza NO nebývá při hypertenzi (někdy je )

NO a hypertenze • NO v mozku výrazně moduluje sympatickou aktivitu + lokální inhibice NOS v mozku -> systémový tlak krve

NO a hypertenze: + Dysfunkce NO není prvotní příčinou hypertenze + Poškození endotelu vysokým tlakem ovšem může sekundárně narušit tvorbu NO + To pak hypertenzi dále zhoršuje

NO při hypercholesterolémii Lidské koronární arterioly in vitro

NO a atheroskleróza Atherosklerotický plát -> endoteliální dysfunkce -> tvorba NO -> paradoxní vazokonstrikce (např. koronární cévy při námaze - angina pectoris) -> ochrana proti tvorbě trombů -> např. až infarkt

Patologie CNS (např. mrtvice, roztroušená sklerosa, . . . ) • • • zánětlivá aktivace glie indukce i. NOS NO inhibuje respiraci neuronů uvolnění glutamátu excitotoxická smrt

NO v terapii • Inhalace plynného NO: + PPHN + ARDS • Šok - pokusná terapie inhibitory NOS (aminoguanidin) (výsledky zatím nejednoznačné) • Erektilní dysfunkce - Viagra (inhibitor PDE V. )

Inhalace NO při ARDS

Inhalace NO při PPHN

Viagra (sildenafil) Příčina dysfunkce: Pacienti se zlepšením erekce (%)