Overlap Extension PCR Primer design Sense template 5

Overlap Extension PCR Primer design Sense template (주형) 5’ 541 586 631 676 721 ttcacatgccctcagtgccgaaagagctttcctcggcggagcttc cgccccaacctgcagctggccaatatggtccaggtgattcggcag atgcacccaacccctggtcgagggagccgcgtgaccgatcagggc atctgtcccaaacaccaagaagccctgaagctcttctgcgaggta gacgaagaggccatctgtgtgccgagaatccaggagccac 3’ F (Forward) Anti-sense template와 결합 R (Reverse) Sense template와 결합 Primer A (F): 5’- atgccctcagtgccgaaagag - 3’ Primer B (R): 5’- tgattcggcagatgcacccgatcaggg - 3’ 5’- ccctgatcgggtgcatctgccgaatca - 3’ Primer C (F): 5’- agatgcacccgatcagggcatctgtcc - 3’ Primer D (R): 5’- gtgtgccgagaatccaggagc - 3’ 5’- gctcctggattctcggcacac - 3’ Reverse primer의 경우 주형 template sequence 그대로 design하면 Anti-sense template에 붙기 때문에 상보적인 Sequence로 바꿔주어 sense template에 결합하게함 상보적인 Sequence 로 바꿔줌

Ligation PCR Discussion Ligation PCR condition Primary PCR condition Temp. (℃) Time 95 2 min 98 2 min 95 30 sec 98 30 sec 55 30 sec 72 1 min 72 5 min 30 cycles 72 I. 5 min 화, 수요일 반의 Ligation PCR 결과가 깨끗하게 나오지 않아 denaturation의 온도를 98 °C로 조정하여 제가 다시 진행하였습니다. II. Template가 GC rich인 경우 denaturation온도를 올려주면 앞의 결과와 같이 specific band와 intensity가 더 잘 나올 수 있습니다. 또 다른 방법으로는 annealing temperature를 조절 하여 적합한 조건을 찾는 것 입니다. III. Extension Time의 경우 1 min 진행하였고, product size 1 kb 당 1 min 진행하면 충분합니다.