Outros testes de sensibilidade a antifngicos Dra Mrcia

Outros testes de sensibilidade a antifúngicos Dra. Márcia Melhem Seção de Micologia Instituto Adolfo Lutz

Métodos para avaliar a resistência a antifúngicos Quando avaliar a resistência a antifúngicos Isolamento de um fungo Como realizar os testes Testes Problemas ainda existentes no método de referência. . . Fenômeno trailing ou arraste observado para azóis e 5 -fc Interpretação dos resultados de MIC ( g/m. L) Sensititre Yeast. One Resultado SDD Comparação de métodos Indicações do teste de sensibilidade Espécies Critérios clínicos para indicação do teste de sensibilidade Considerações finais índice

Métodos para avaliar a resistência a antifúngicos Difusão a partir de discos Difusão a partir de fitas Diluição em agar Diluição em meio líquido em tubos = macrodiluição em placas = microdiluição

Quando avaliar a resistência a antifúngicos? Infecção ou colonização? Critérios microbiológicos e clínicos para indicação do teste de sensibilidade a antifúngicos

Isolamento de um fungo Levedura Fungo Filamentoso (bolor)

Microbiota humana transiente ou permanente MEIO AMBIENTE MICROBIOTA (pele, mucosas, TR, TGI, TU) + MEIO AMBIENTE Microbiota transiente (pele, mucosas, TR) + MEIO AMBIENTE AGENTE ETIOLÓGICO

Como realizar os testes? Colônia pura Plaqueamento Cultura mista é uma causa comum de erro! Manutenção Freezer a -20 80°c

Como realizar os testes? 1. Inóculo Suspensão de células do fungo Soluçãopadrão= 106 ufc/m. L = Comparação para ajuste de turbidez: espectrofotômetro ou visual INÓCULO

Como realizar os testes? 2. Condições INÓCULO X ANTIFÚNGICO (s) = Sensibilidade CONDIÇÕES PARA O TESTE: temperatura, tempo e meio de cultura Meio Sólido (agar) Meio Líquido (caldo)

Método de Difusão por Discos. . . técnicas em agar Vantagens Parâmetros definidos para Candida e FZ (M 44 P) Fácil de realizar Similaridade com antibiograma Desvantagens Falta padronização para outras drogas Resultado somente em 3 categorias que não indicam pequenas alterações ou tendência para ® Não fornece a concentração inibitória mínima (MIC), apenas correlaciona MIC com diâmetro do halo

Método de difusão por fitas. . . técnicas em agar Vantagens: Resultado em CIM = MIC Facilidade de execução Disponível no comércio Desvantagens: Produto importado (custo) Trailling Leitura subjetiva Inóculo variável

Técnicas em agar Diluição em ágar Diversas placas, cada uma contendo agar com diferentes concentrações de um AFG Inóculo na superfície (fungos de crescimento lento, dermatófitos, agentes de cromomicose) Observa-se a inibição do fungo na CIM (Vantagem sobre técnica de disco) fungo 64 65 32 16 8 4 2 ( g/m. L) 1 0, 5 Placa com agar e afg

Variante do teste em placa: Teste Rápido para leveduras frente a FZ Agar com FZ (8 g/m. L) Colônias pequenas: sensíveis Colônias grandes: resistentes Mas, requer ainda melhor avaliação com cepas R

Testes em meio líquido Em tubos = macrodiluição ou macrométodo Em placas de microtitulação = microdiluição ou micrométodo Método de Referência para leveduras (Candida spp e Cryptococcus neoformans) Doc. M 27 -A, 2002 - NCCLS Método de Referência para Fungos Filamentosos (Aspergillus, Fusarium, Rhizopus e Scedosporium) Doc. M 38 -P, 2002 - NCCLS

Macrométodo Série de 10 tubos com várias concentrações do antifúngico + inóculo do fungo Após 24 a 72 h observa-se os tubos em que houve inibição de crescimento Entre esses tubos, o que contém a menor concentração corresponde ao MIC

Micrométodo em placa CONCENTRAÇÕES DECRESCENTES DO ANTIFÚNGICO INÓCULOS Controle de esterilidad e do meio Inóculos cepas ATCC MIC Controle de crescimento dos inóculos

Micrométodo em placa Automatização = resultados acurados Meio RPMI + 2% glicose em tampão MOPS = inerte Placas de microtitulação, 96 orifícios= economia de reagentes Placas contendo [FZ] de 0, 12 até 64 g/m. L; [IZ] e[ AB] de 0, 015 a 8 g/m. L= armazenadas e congeladas, prontas para uso Leitura da inibição: visual ou espectrofotométrica com valor da d. o. impressa em fita = rastreabilidade de resultados Determinação do MIC: Para azóis = desprezar crescimento residual devido ao trailing MIC é concentração que inibe 50% do crescimento, em relação ao controle positivo (coluna 12) Para AMB: concentração que inibe 100% do crescimento

Micrométodo em placa

Vantagens: acurácia (procedimento e leitura)

Problemas ainda existentes no método de referência. . .

Fenômeno trailing ou arraste observado para azóis e 5 -fc AB 100% 16 µg/ml 8 4 2 1 0. 5 0. 25 0, 12 0, 06 C+ de inibição (NCCLS) 90% (EUCAST) CIM Azóis 80% 64 µg/ml 32 16 8 4 2 1 0, 5 0, 25 C+ Inibição (MACRO) CIM 50% de inibição (MICRO)

E ainda. . . Método tem baixa sensibilidade p/ identificar cepas resistentes à anfotericina B - AMB. Não é viável para laboratório de análises clínicas (complexidade e custo). Algumas espécies de leveduras não crescem bem nas condições de incubação (T , t, meio de cultura? ) Outros métodos denominados NCCLS-like : Europa: comitê da ESCMID = EUCAST (modificações na microdiluição: adição de glicose ao meio de cultura, suspensão mais concentrada do fungo, leitura antecipada, agitação das placas, etc. . . ).

Interpretação dos resultados de MIC ( g/m. L) S SDD R <8 16 - 32 > 64 Afg FZ IZ < 0, 25 -0, 5 >1 AMB <2 - >2 S = sensível; R = resistente; NCCLS 2002 SDD = sensibilidade dependente da dose: 100 mg/dia= 6 -7 ug/m. L de soro FZ 400 mg/dia= 20 ug/m. L de soro 800 mg/m. L=50 -60 ug/m. L de soro

Sensititre Yeast. One • • • Indicador Alamar Blue (oxidação-redução) 2 cepas/placa x IZ, FZ, 5 FC Película selante. Incubação 35°C/24 h – 48 h Crescimento: negativo inibição parcial ( trailing) positivo

Resultado SDD Concentrações séricas de FCZ Dose diária de FZ (mg/dia) Concentração sanguínea ( g/m. L) 100 6 400 20 -30 800 40 -60

Comparação de métodos [Ramani & Chatu. Rverdi JCM 2003; 41] 17 laboratórios de Nova York, USA • • 5 cepas ATCC Correlação boa: • AMB = 85 % • FZ = 74 % E-test (3/17) Microdiluição (14/17) Maiores erros: • Apenas 1/17 indicou C. krusei FZ® • Nenhum indicou C. lusitaniae AMB®

Comparação de métodos 235 cepas de Candida glabrata E-test com azul de metileno Difusão por discos FZ = 91 -96% Microdiluição VZ = 93 -95% Pfaller et al. , 2003 726 cepas de Candida sp E-test Microdiluição Caspofungina = alta correlação, exceção C. lusitaniae Pfaller et al. , 2002

Comparação de métodos 102 cepas Candida spp e Saccharomyces cerevisiae E-test Microdiluição Correlação E test x NCCLS VZ = 100% Correlação E test x NCCLS Caspofungina = 89% Chryssanthou, E & Cuenca-Estrella JCM 2002; 40

Indicações do teste de sensibilidade Critério microbiológico: depende da identificação da espécie

Após a identificação da espécie. . 1. Espécie reconhecidamente, resistente ® aos azóis ou anfotericina B 2. Espécie sensível

Espécies: 3 tipos ® ® INTRÍNSECA: todos os membros são ® Ex. : fungos filamentosos e levedura Candida krusei frente ao fluconazol (FZ) Há indicação do teste de sensibilidade ao FZ ? não E para outros azóis? sim

Espécies ® ® NATURAL: alguns membros são ® Ex. : Candida glabrata ao FZ C. lusitaniae, Aspergillus, Rhizopus à anfot. B (AMB) Há indicação do teste de sensibilidade ? sim

Espécies ® ® ADQUIRIDA: após exposição à droga, alguns membros, ou todos, tornamse ® Ex. : C. glabrata, C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis e outras espécies a FZ, itraconazol e cetoconazol Há indicação do teste de sensibilidade ? sim

Candida glabrata Desenvolve ® de modo muito rápido, poucas horas de exposição ao FZ. Não se recomenda tratar infecções caudadas por C. glabrata com FZ.

Espécies reconhecidamente, sensíveis Avaliação da sensibilidade in vitro não precisa ser feita de rotina, para a orientação terapêutica. A identificação da espécie, em regra, é suficiente para manter ou re-orientar tratamento.

Critérios clínicos para indicação do teste de sensibilidade Paciente com histria de profilaxia com azól. Caso de falha terapêutica. Caso com infecção por espécie com perfil de sensibilidade desconhecido ou pouco estudado.

Considerações finais 1. Testes em agar podem ser úteis para triagem de cepas resistentes, desde que, realizadas dentro de um protocolo rígido, com cepas-padrões e monitorados por um laboratório de referência (método NCCLS ou NCCLS-like). 2. Os métodos de referência não são aplicáveis a todas as espécies de fungos. 3. Não existe um método com boa sensibilidade para identificar cepas AMB ®. 4. A aplicação clínica de testes de sensibilidade a antifúngicos é limitada.