Organizzazione delle unit di ripetizione dei geni per

Organizzazione delle unità di ripetizione dei geni per gli istoni in diverse specie

Tutti i genomi contengono copie multiple dei geni per l’r. RNA e per i t. RNA

Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S. p. A. Copyright © 2006

I PRECURSORI DEGLI r. RNA SONO PIU' LUNGHI DELLA SOMMA DEI DUE r. RNA MATURI

I precursori degli r. RNA subiscono maturazione

I geni per gli r. RNA sono ripetuti in tandem nei genomi eucariotici NTS ETS 18 S 28 S ITS RNA DNA DNA other repetitive elements 60/81 bp repeats spacer promoter gene promoter

Amplificazione DNA • Clonaggio • PCR

Vettori di clonaggio Plasmidi Virus Trasposoni Minicromosomi artificiali

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sito di restrizione Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S. p. A. Copyright © 2006

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Gli enzimi di restrizione possono generare diversi tipi di estremità

Uso degli enzimi di restrizione • Clonaggio • Mappa di restrizione • Polimorfismi di restrizione (RFLP)

Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

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Elementi di un vettore plasmidico 1. Origine di replicazione 2. Marcatore di selezione 3. Sito di restrizione unico

Vettori plasmidici

Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

Preparazione del DNA da clonare Digestione clone già esistente DNA specifico PCR frammentato con enzimi di restriz. Frammento di DNA genomico che può contenere regioni trascritte o non trascritte frammentazione Collezione DNA (banca, genoteca) c. DNA: meccanica DNA ottenuto per trascrizione inversa dell’m. RNA, che quindi contiene tutto o parte di una regione trascritta

Collezioni di DNA clonato (banca c. DNA, genoteca) Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S. p. A. Copyright © 2006

RNA PREPARAZIONE del c. DNA Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S. p. A. Copyright © 2006

Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

Unione, mediante ligasi, di estremità coesive create da un enzima di restrizione VETTORE GAATTC CTTAAG Eco. RI GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC G G CTTAA GAATTC CTTAAG DNA ligasi GAATTC CTTAAG INSERTO

Reazione di ligasi • strategie • controlli

Inserzione di un frammento di DNA in un vettore circolare mediante ligasi di estremità coesive VETTORE AATTC G G CTTAA GAATTC CTTAAG INSERTO TC AT AG GATTA C DNA ligasi G CT AAT TA TC AG Eco. RI

Clonaggio con singola digestione trattamento del vettore con fosfatasi p. AATTC G G CTTAAp AATTC G � � G CTTAA � C TT p. G AA A G TTA C DNA ligasi G CTp. AA TA TT A C G fosfatasi

Clonaggio con doppia digestione Eco. RI Hind. III GAATTC AAGCTT CTTAAG TTCGAA � � AGCTT G A CTTAA AATTC G Eco. RI GAATTC CTTAAG � A TTCGA Hind. III � TT GC AA AATCG T DNA ligasi G CT AAT TA TC AG �

Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

Introduzione del DNA nella cellula ospite Trasformazione: Ca. Cl 2 Elettroporazione In E. coli Impacchettamento e infezione fagica Trasfezione (transiente o stabile): Calcio fosfato Liposomi In cellule di eucarioti superiori Elettroporazione Microiniezione DNA gun

Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

Vettori plasmidici

Strategie di selezione nel clonaggio AMPICILLINA resistenza AMPICILLINA

Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

Sac. I 1200 bp Eco. RI

Isolamento acidi nucleici 1. lisi cellulare 2. deproteinizzazione 3. concentrazione

Analisi acidi nucleici • Spettrofotometro (quantitativa) • Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa)

Spettro di assorbimento del DNA 1. 5 Assorbanza (OD) 1 OD 260=50 g/ml 1. 0 OD 260/OD 280=1, 8 -2, 0 0. 5 220 240 260 280 300 320 lunghezza d’onda (nm)

Elettroforesi di acidi nucleici • Gel di agarosio • Gel di acrilammide

Elettroforesi su gel di agarosio

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Migrazione del DNA su gel Le molecole lineari di ds. DNA migrano a velocità inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.

http: //www. youtube. com/watch? feature=player_detailpage&v=lgmq_Hsu. ZIU http: //www. youtube. com/watch? v=6 m. QGNDn. Oy. H 8

Fattori che influenzano la migrazione • Peso molecolare • Concentrazione di agarosio • Conformazione DNA • Voltaggio applicato • Intercalanti • Tampone di elettroforesi

Visualizzazione del DNA

Marcatori di peso molecolare �Hind. III

Tecniche di trasferimento su membrana (Blotting) • Southern (blot) • Northern (blot) • Western (blot)

BLOTTING (TRASFERIMENTO) Southern Northern Western Molecole trasferite Sonda Gel DNA o RNA Agarosio o acrilammide RNA DNA o RNA Agarosio o acrilammide Proteine Anticorpi Acrilammide

Metodi di trasferimento • Capillare • Elettroblot

Assemblaggio del blot capillare vaschetta carta 3 MM } membrana nylon gel supporto tampone

Fattori che influenzano l’ibridazione • Temperatura • Forza ionica • p. H

Esempio di Southern blot genomico

Analisi di espressione (m. RNA)