ORGANIZAREA MATERIALULUI GENETIC Din punct de vedere funcional

ORGANIZAREA MATERIALULUI GENETIC

Din punct de vedere funcţional se disting trei niveluri de organizare a materialului genetic: -genic -cromozomial -genomic

U. M. F IAŞI STRUCTURA GENOMULUI UMAN GU = un genom nuclear (complex, 99, 5% ADN) + un genom mitocondrial (simplu şi mic, 0, 5%). 35. 000 gene

In genomul uman există mai multe tipuri de ADN, diferite prin repetiţia secvenţelor nucleotidice: • ADN nerepetitiv, (60%) este alcătuit din secvenţe unice per genom la nivelul cromozomilor se gaseste in benzile eucromatice, la nivel genic se gaseste in exoni • ADN moderat repetitiv (30 %) este alcătuit din secvenţe scurte repetate de zeci şi sute de mii de ori şi dispersate în genom. Se gaseste in: – elemente retrotranspozabile din clasa LINE-elemente lungi de spaţiere – elementele SINE- elemente mici de spatiere – gene care codifica ARNr si ARNt • ADN înalt repetitiv (10 % din genom) este alcătuit din secvenţe foarte scurte repetate în tandem ( ), de milioane de ori; ele nu sunt transcrise. Se clasifica in: – ADN satelit din regiuni heterocromatice, pericentromerice si la nivelul telomerelor – ADN minisatelit cuprinde secvente polimorfe si sunt localizate la nivelul telomerelor – ADN microsatelit este reprezentat de numarul repetarilor intr-un anumit locus si cel mai bine caracterizat este cromozomul Y.

Caracteristici Genom nuclear Genom mitocondrial Mărime 3200 Mb 16, 6 Kb Număr de molecule de ADN diferite 23 (la celulele XX) sau 24 (la celulele XY) O moleculă circulară de ADN Asocierea cu proteine Mai multe clase de histone şi proteine nehistonice Neasociat cu proteine Procentul de ADN codant 10 % 97 % Număr de gene 35. 000 gene 37 gene: 13 gene structurale, 22 gene ARNt si 2 gene ARNr Introni Prezenţi în cele mai multe gene Absenţi Ereditate Mendeliana pentru genele de pe autosomi şi cromosomul X; paternală pentru secvenţele de pe Y Exclusiv maternă

• In cromozomii eucariotelor, ADNul reprezinta 1316 %, ARN -ul 12 13 % iar proteinele histonice si non histonice 68 -72 %.

HISTONELE H 1 - bogata in lizina H 2 A - bogata in leucina H 2 B - bogata in serina H 3 - bogata in arginina si cisteina H 4 - bogata in arginina

• Histonei H 10 (numită şi H 5) care lipseşte în celulele care se divid şi apare în celulele diferenţiate • Histona H 2 AZ, cu rol important în reglarea transcripţiei. • CENP-A este o proteină înrudită cu H 3 care rol major în activitate centromerilor.

NON HISTONELE DNA • HMG “ high mobility group” • SARs ( scaffold associated regions). HMG-box domain

CROMATINA • Prezinta diferite grade de condensare si se prezinta sub doua tipuri morfofunctionale distincte : eucromatina si heterocromatina ( clasificare facuta de E. Heitz in 1928). Heterocromatina • este de doua feluri : constitutiva si facultativa ( clasificare facuta de S. Brown in 1975).

Caracteristici EUCROMATINA HETEROCROMATINA Condensare Fin dispersată Puternic condensată Compoziţie chimică Predomină p. b. C - G; ADN nerepetitiv; proteine nehistonice Predomină p. b. A - T; ADN repetitiv; proteine histonice Colorare Slabă Intensă Activitate genetică Activă Inactivă Replicare în faza S Precoce Tardivă

• Heterocromatină constitutivă

Heterocromatină facultativă - ex cel mai tipic îl constituie cromatina sexuală

Heterocromatina Eucromatina

NUCLEOZOMUL

• Nucleozomul contine cantitati aproximativ egale de AND si histone. Masa moleculara a nucleosomului este de cca 262 000 de daltoni, fiind alcatuita astfel : H 1 = 24000 H 2 A X 2 = 28000 H 2 B X 2 = 28000 H 3 X 2 = 30000 H 4 X 2 = 22000 Deci in total histonele reprezinta 132000 de daltoni si AND diferenta de 130000 de daltoni ( cca 200 pb).

• Prin microscopie electronică s-au identificat nucleozomii de aprox. 11 nm în diametru şi 6 nm în înălţime, legati între ei prin fire subţiri de acid dezoxiribonucleic.

Etape în structurarea fibrei nucleosomice: A. Alcatuirea miezului histonic (cate 2 molecule din H 2 A, H 2 B, H 3, H 4).

• B. O secventa de ADN (de 146 pb) se infasoara de in jurul miezului histonic

• C. Histona H 1 leaga doi nucleozomi vecini

SOLENOIDUL • pasul de 6 nucleozomi • diametrul de 30 nm • compactare de 5 ori

filament de nucleozomi 10 nm filament de solenoid 30 nm

BUCLE LATERALE • 20 -100 kb • diametrul de 300 nm • buclele sunt ataşate la un "schelet" sau matrice proteică “regiunile de ataşare la matrice" ( SAR) sunt bogate în A-T • proteinele non histonice Sc 1 si Sc 2 ( ‘’scaffold”)

• - hipercondensare • - fibra bucleiforma se rasuceste suplimentar(grad compactare 20) • - 30 proteine non histonice • - nr rasuciri la cr 1 ar fi de 29 -33 rotatii • - cromatida unui cromosom cu diametrul de 700 nm

Structura cromozomilor metafazici 2 cromatide unite printr-un centromer

• • • OM - 46 MAIMUTA - 42 CIMPANZEU - 48 BOVINE - 60 CAINE - 78 PISICA - 38 CAL - 64 SOARECE - 40 DROSOPHILA – 8 CRAPUL -104

Metode de obtinere a cromozomilor Tehnici citogenetice clasice

Sisteme de Cariotipare

Cariotipul Cariotip – aranjarea sistematizata a cromozomilor unei celule ISCN (International System for Human Cytogenetics Nomenclature) a stabilit o serie de abrevieri Formula de baza are 3 itemi separati de virgula: primul precizeaza nr de cromozomi (46); al doilea constitutia cromozomilor sexuali (XX, XY); al treilea anomaliile de nr si structura ale autozomilor ; Ex: 46, XX, t(9; 22), +8 In urma tehnicilor de bandare fiecare brat cromozomial poate fi divizat in mai multe regiuni, iar o regiune in benzi si subbenzi. Ex : 1 q 21. 1 – cromozom 1, brat lung, regiunea 2, banda 1, subbanda 1.

Cariotip-bandare GTG

Tehnici de citogenetica moleculara Hibridizarea în situ cu fluorescenţă (FISH) este o metodă de citodiagnostic molecular în care, are loc hibridizarea, pe bază de complementaritate, între o secvenţă specifică din ADN-ul cromozomului analizat (ADN ţintă) şi o sondă de ADN. Tipuri de sonde: - centromerice - telomerice - specifice unui intreg cromozom Testele FISH se pot efectua pe - nuclei interfazici din celule ale lichidului amniotic - celule ale vilozităţilor coriale - limfocite, celule din măduva osoasă, tumori solide

HIBRIDIZARE FLUORESCENTA IN SITU (FISH)

Aspect normal al nucleului interfazic(sex feminin) Aspect normal al nucleului interfazic(sex masculin)

FISH în sindromul Down FISH la sindromul Edwards