Optimizacin del ensayo de Crossmatch por Citometra de

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Optimización del ensayo de Crossmatch por Citometría de Flujo (Halifax) para agilizar la evaluación

Optimización del ensayo de Crossmatch por Citometría de Flujo (Halifax) para agilizar la evaluación del riesgo inmunológico previo al trasplante. Luciana Mas Dra en Bioquímica Lab. Histocompatibilidad. Hospital Privado. Universitario de Córdoba.

 • El Crossmatch contra donante por citometría de flujo (FXCM) es utilizado en

• El Crossmatch contra donante por citometría de flujo (FXCM) es utilizado en combinación con ensayos de fase sólida para determinar la presencia y fuerza de los anticuerpos anti-HLA donante específicos (DSA). *La CF es más sensible que la prueba de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). *Permite detección de anticuerpos anti-HLA que se encuentran a niveles bajos. *Mejora la evaluación del riesgo inmunológico antes del trasplante. • Estos anticuerpos FCXM+/CDC- son clínicamente relevantes y si se reconocen antes del trasplante se puede evitar el rechazo mediante la selección de un donante alternativo o por desensibilización del paciente.

 • El protocolo estándar de FCXM de tres colores utilizado actualmente por la

• El protocolo estándar de FCXM de tres colores utilizado actualmente por la mayoría de los laboratorios, se describió hace más de 25 años. • Se puede dividir en dos partes: - La primera consiste en el enriquecimiento de linfocitos de los donantes utilizando un gradiente de Ficoll seguida del tratamiento de las células del donante con pronasa para reducir la expresión del receptor Fc y eliminar las células muertas. - La segunda parte consiste en el ensayo de crossmatch y la detección de anticuerpos por citometría de flujo.

Protocolo Estándar FCXM • Incubación de 9 x 106 linfocitos del potencial donante con

Protocolo Estándar FCXM • Incubación de 9 x 106 linfocitos del potencial donante con 20 µl de suero control negativo, positivo y suero del potencial receptor: 30 min, seguida de 2 lavados con PBS de 5 min. • Incubación con anti-Ig. G humana marcada con FITC: 30 min seguida de 1 lavado con PBS de 5 min. • Incubación con anti-CD 3 PE, anti- CD 19 APC y anti-CD 45 Per. CP: 20 min seguida de 1 lavado con PBS de 5 min. • Este procesamiento insume 100 minutos al cual hay que agregarle el tiempo requerido para obtener la suspensión celular y manipulación.

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 • Los resultados son expresados como positivo o negativo y en caso de

• Los resultados son expresados como positivo o negativo y en caso de ser positivos se informa el valor numérico que esta basado en: a) Un cambio en la mediana de la intensidad de fluorescencia del canal (Median Channel Shift, MCS, valores lineales) del suero en estudio con respecto a un control negativo. b) Relación de media de suero del paciente respecto a la media del CN obtenida de gráficos de tipo dot plot, tomándose como punto de corte el valor de 2 para considerar el crossmatch como positivo.

FCXM Linfocitos T Poblaciones Linfocitarias FCXM Linfocitos B NEGATIVO POSITIVO

FCXM Linfocitos T Poblaciones Linfocitarias FCXM Linfocitos B NEGATIVO POSITIVO

El protocolo entero requiere tiempo, típicamente de cuatro horas, pudiendo llevar a retrasos significativos

El protocolo entero requiere tiempo, típicamente de cuatro horas, pudiendo llevar a retrasos significativos en los trasplantes y comprometiendo la calidad de los órganos. El grupo de Robert Liwski, desarrolló y validó dos ensayos de FCXM, denominados protocolos Halifax y Halifaster: Objetivo: desarrollar un procedimiento acelerado de FCXM sin alterar la calidad y la sensibilidad del ensayo estándar. Se validó un protocolo de FCXM optimizado rápido, que tarda 35 -40 minutos en realizarse, manteniendo al mismo tiempo una excelente sensibilidad del ensayo.

Protocolos de Citometría de Flujo Protocolo Halifax Parámetro Protocolo Halifaster Protocolo Hospital Privado Plataforma

Protocolos de Citometría de Flujo Protocolo Halifax Parámetro Protocolo Halifaster Protocolo Hospital Privado Plataforma del ensayo Placa 96 pocillos Tubos 12 x 75 mm Vol. de suero 50 µl 30 µl 20 µl Separación de células Ficoll Hypaque Vol. celular 25 µl 15 µl 300 µl Tiempo 1° incubación 20 minutos Lavados (1° set) Vol. buffer de lavado 20 minutos Tratamiento con pronasa para clivar los receptores Fc 3 x 1 min a 500 g 30 minutos 200 µl 25 minutos de incubación de células 200 µl 100 µl con pronasa + lavados = 40 50 µl minutos 2000 µl 2 x 5 minutos a 500 g CD 45 -Per. CP; CD 19 APC; CD 3 PE (*) 5 µl de anti-Ig. G CD 45 -Per. CP; CD 19 APC; CD 3 PE Tiempo 2° incubación 10 minutos 5 minutos 20 minutos Lavados (2° set) 2 x 1 min a 500 g 2 x 5 minutos a 500 g Vol. final suspensión 400 µl 500 µl Tiempo total ensayo 35 minutos 30 minutos 120 minutos Vol. anticuerpos

Modificaciones de la técnica estándar. • Incremento en el volumen de suero. Finalidad: aumentar

Modificaciones de la técnica estándar. • Incremento en el volumen de suero. Finalidad: aumentar la sensibilidad de la técnica, sobretodo para detectar niveles bajos de anticuerpos donante específicos. Aumenta la relación suero/célula. • Unificación de los pasos de marcación. Obtención del MISMO resultado marcando primero con anti-Ig. G y luego anti-CD 3, anti-CD 19 y anti-CD 45 que colocando todos los marcadores en un solo paso.

Modificaciones de la técnica estándar. • Plataforma del ensayo. Se largaron múltiples reacciones en

Modificaciones de la técnica estándar. • Plataforma del ensayo. Se largaron múltiples reacciones en paralelo respetando absolutamente todos los parámetros de la técnica estándar. Se compararon los resultados de ambas plataformas en cada una de las reacciones. Análisis de regresión lineal simple mostró un r 2 de 0. 993. En general, los análisis de regresión mostraron coeficientes de correlación altos, demostrando una gran fuerza de asociación entre las dos plataformas de trabajo.

 • Las pruebas realizadas contemplaron además, la búsqueda de anticuerpos en las mismas

• Las pruebas realizadas contemplaron además, la búsqueda de anticuerpos en las mismas muestras mediante la utilización de LABScreen® Single Antigen Beads (One Lambda, California, USA). CASO: *Pedido de Crossmatch contra donante por CF (pre-trasplante donante vivo). *Derivación de un centro de trasplante. *CDC contra donante: negativo (otro laboratorio).

Crossmatch contra donante por CF. Técnica: variante Halifax Control Negativo Linfocitos T Control Positivo

Crossmatch contra donante por CF. Técnica: variante Halifax Control Negativo Linfocitos T Control Positivo Linfocitos T Suero paciente (puro) Suero paciente (1/50) Control Negativo Linfocitos B Control Positivo Linfocitos B Suero paciente (puro) Suero paciente (1/50)

11. 000 MFI HLA R: A*68/02 B*62/- DRB 1*14/04 HLA D: A*68/- B*62/44 DRB

11. 000 MFI HLA R: A*68/02 B*62/- DRB 1*14/04 HLA D: A*68/- B*62/44 DRB 1*14/17

< 300 MFI

< 300 MFI

Los resultados obtenidos mediante la técnica Halifax mostraron una mayor sensibilidad en la detección

Los resultados obtenidos mediante la técnica Halifax mostraron una mayor sensibilidad en la detección de anticuerpos que se encuentran a niveles bajos, identificados como anticuerpos específicos de donante mediante la realización de XM virtual, comparado con la técnica estándar(*) (*)corrimiento en los valores de MCS de los sueros positivos.

La implementación del protocolo Halifax nos permitirá reducir los tiempos de la realización de

La implementación del protocolo Halifax nos permitirá reducir los tiempos de la realización de la prueba de FCXM, agilizando la distribución de órganos en los operativos de trasplante y disminuyendo los tiempos de isquemia fría.