OPTIMALISATIE VAN HET ISOLEREN EN IN CULTUUR BRENGEN

OPTIMALISATIE VAN HET ISOLEREN EN IN CULTUUR BRENGEN VAN OSTEOCYTEN Laura Vernieuwe MRB afdeling reumatologie Stagementor: Dr. Stijn Lambrecht Promotor: Griet Vanbillemont

INHOUDSOPGAVE 1. Inleiding en probleemstelling 2. Cellen in het bot 3. Methode 4. Resultaten en discussie 5. Besluit en toekomstperspectief

1. INLEIDING EN PROBLEEMSTELLING Ideaal: In vitro cultuur van osteoblasten, osteocyten en osteoclasten. Osteocyten: Diep gelegen in matrix van het bot Niet of moeilijk te differentiëren uit precursoren Bestaand protocol optimaliseren voor het isoleren en opkweken van osteocyten uit botjes van muizen.

2. CELLEN IN HET BOT Osteoblasten Precursor: mesenchymale stamcellen Kubisch tot cilindrisch Botvorming Leven slechts enkele weken Osteocyt Inactieve osteoblast Apoptose

2. CELLEN IN HET BOT Osteoclasten Precursor: hematopoëtische stamcellen Meerdere kernen Botafbraak Samenspel osteoblasten en osteoclasten remodellering van het bot

2. CELLEN IN HET BOT

2. CELLEN IN HET BOT Osteocyten Precursor: mesenchymale stamcellen Langlevende cellen Liggen in lacunes Cytoplasma uitlopers Functie: Mechanosensorische cellen Handhaven van calcium in bloed

2. CELLEN IN HET BOT

3. METHODE Dissectie van de muis Verwijderen achterpoten muis Vel en haren verwijderen 70% ethanol Beenmerg verwijderen Botjes kleiner maken Isoleren van osteocyten 3 verschillende protocols

3. METHODE Fractie Protocol 1 Protocol 2 Protocol 3 Ethanol (15 sec. ) / 1 Collagenase (20 min. ) 2 Collagenase (20 min. ) 3 Collagenase (20 min. ) 4 Collagenase (20 min. ) EDTA (30 min. ) Collagenase (20 min. ) 5 EDTA (20 min. ) Collagenase (30 min. ) EDTA (20 min. ) 6 Collagenase (20 min. ) EDTA (30 min. ) Collagenase (20 min. ) / / Botjes kleiner maken 7 EDTA (20 min. ) Collagenase (30 min. ) EDTA (20 min. ) / Botjes kleiner / maken 8 Collagenase (20 min. ) EDTA (1 uur) Collagenase (20 min. ) 9 / Collagenase (30 min. ) /

3. METHODE In cultuur brengen van de cellen Protocols 1 & 2 6 wellplaat Protocol 3 24 wellplaat FBS coating CO 2 incubator Osteocalcine kleuring Kleuren osteoblasten en osteocyten

$4. RESULTATEN EN DISCUSSIE Celopbrengst per fractie voor incubatie Totaal aantal cellen (103) 450$

4. RESULTATEN EN DISCUSSIE Celopbrengst per fractie voor incubatie Totaal aantal cellen (103) 450 Protocols 1&3 400 350 300 250 Protocol 1 200 Protocol 3 150 100 50 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Fractie Protocol 2 Totaal aantal cellen (103) 35 30 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 Fractie 8 9

$4. RESULTATEN EN DISCUSSIE Celopbrengst per fractie voor incubatie Totaal aantal cellen (103) 450$

4. RESULTATEN EN DISCUSSIE Celopbrengst per fractie voor incubatie Totaal aantal cellen (103) 450 Protocols 1&3 400 350 300 250 Protocol 1 200 Protocol 3 150 100 50 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Fractie Protocol 2 Totaal aantal cellen (103) 35 30 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 Fractie 8 9

$4. RESULTATEN EN DISCUSSIE Celopbrengst per fractie voor incubatie Totaal aantal cellen (103) 450$

4. RESULTATEN EN DISCUSSIE Celopbrengst per fractie voor incubatie Totaal aantal cellen (103) 450 Protocols 1&3 400 350 300 250 Protocol 1 200 Protocol 3 150 100 50 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Fractie Protocol 2 Totaal aantal cellen (103) 35 30 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 Fractie 8 9

$4. RESULTATEN EN DISCUSSIE Celopbrengst per fractie voor incubatie Totaal aantal cellen (103) 450$

4. RESULTATEN EN DISCUSSIE Celopbrengst per fractie voor incubatie Totaal aantal cellen (103) 450 Protocols 1&3 400 350 300 250 Protocol 1 200 Protocol 3 150 100 50 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Fractie Protocol 2 Totaal aantal cellen (103) 35 30 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 Fractie 8 9

4. RESULTATEN EN DISCUSSIE Totale celopbrengst per protocol 600 529000 Totaal aantal cellen (103) 500 496200 400 300 200 108900 100 0 1 2 Protocol 3

$5. RESULTATEN EN DISCUSSIE Aantal cellen in botfractie na 8 dagen incubatie (protocol 3)$

5. RESULTATEN EN DISCUSSIE Aantal cellen in botfractie na 8 dagen incubatie (protocol 3)

5. RESULTATEN EN DISCUSSIE Veel fibroblasten

$5. RESULTATEN EN DISCUSSIE Osteocalcine kleuring protocol 3 botfractie met FBS coating Negatieve controle$

5. RESULTATEN EN DISCUSSIE Osteocalcine kleuring protocol 3 botfractie met FBS coating Negatieve controle

5. RESULTATEN EN DISCUSSIE Osteocalcine kleuring

6. BESLUIT EN TOEKOMSTPERSPECTIEF Niet te lang behandelen met 70% ethanol Botjes kleiner maken FBS coating Gevoelig voor splitsen Optimalisatie omtrent isolatie, groeiomstandigheden en controle kleuring

OPTIMALISATIE VAN HET ISOLEREN EN IN CULTUUR BRENGEN VAN OSTEOCYTEN Laura Vernieuwe MRB afdeling reumatologie Stagementor: Dr. Stijn Lambrecht Promotor: Griet Vanbillemont

3. METHODE Dissectie van de muis Vel met haren verwijderen door knieschijf vast te nemen en aan het vel te trekken Botjes met zacht weefsel weken in steriele PBS Zacht weefsel en periost verwijderen door schrapen met scalpel Verkregen botten 15 sec. onderdompelen in 70% ethanol Botten wassen met steriele PBS Epifyse afsnijden en beenmerg verwijderen met steriele PBS door middel van een injectiespuit Botten wassen, snijden in de lengte en kleiner maken in 1 – 2 mm stukjes om het oppervlak te vergroten. Stukjes bot overbrengen in een epje

3. METHODE Osteocalcine kleuring Medium afnemen Fixeren met 200µL 4% paraformaldehyde (15 min. op KT) 200µL 0, 1% Triton X-100 (4 min. op ijs) 200µL 1% BSA (2 h op KT) 200µL primair AL (1 h op 37°C) Wassen met 200µL PBS (3 x) 200µL secundair AL (30 min. op 37°C in het donker) Wassen met 200µL PBS (3 x) 1 druppel DAPI Afdekken met een draagglaasje Bekijken met een fluorescentiemicroscoop