Oppsummering av immunologikurs Bjarte G Solheim Dag 1

Oppsummering av immunologikurs Bjarte G. Solheim

Dag 1 • Presipitasjon, dobbeldiffusjon i agarose • Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) • Hemolyse • Agglutinasjon

Dobbeldiffusjon i agarose

ELISA • Bestemmelse mengden av anti HBs. Ag i blod OD 3 6 12 24 IE antistoff mot HBs. Ag / liter

Hemolyse Skrift kunne leses gjennom det hemolyserte blodet, men ikke gjennom blodlegemer i løsning.

Agglutinasjon

ABO systemet A antigen A transferase Karbohydrat antigen H substans B transferase B antigen Manglende transferase (Stumt gen) H substans ( O antigen )

ABO systemet • Det klinisk viktigste blodtypesystem Mange antigener på blodlegemene Antistoffer rettet mot A og B egenskaper aktiverer komplement effektivt Antistoffer av Ig. M type dannes mot de antigener mangler uten forutgående transfusjon el. svangerskap Uforlikelige blodlegemer hemolyseres oftest av komplement straks de kommer i sirkulasjonen • ABO uforlikelige transfusjoner har > 10% dødelighet • Forbytninger er viktigste årsak til ABO uforlikelige transfusjoner

ABO systemet Individets blodtype O A B AB Antistoffer mot A antigen B antigen + + – – –

Transfusjon i ABO systemet For røde bllg. O A B AB For plasma AB A B O

Irregulære reaksjoner ved ABO typing • ABO typen bestemmes av blodlegemenes reaksjon med typereagens • Reaksjonen mellom plasma og kontrollblodlegemer – tjener som kontroll på at det foreligger antistoffer mot de antigener pasienten mangler i ABO systemet – ved irregulære reaksjoner ser vi uventede reaksjoner mellom plasma og kontrollblodlegemer • Årsak til irregulære reaksjoner – alloantistoffer etter transfusjon eller svangerskap, reagerer med A 1 c el. Bc men ikke med egne blodlegemer – kuldeagglutininer, reagerer med både A 1 c, Bc og egne blodlegemer, agglutinatet løses opp ved 370 C, agglutinasjonen kommer tilbake etter avkjøling – pengeruller, reaksjonen sees med alle celler, men blir borte etter 1 x vask med saltvann

Alloantistoff Pengeruller

Rh systemet • To nært koblete genloci: D og CE • Vanlige genotyper i norsk befolkning: – DCe (R 1), dce (r) og Dc. E (R 2) • Seks alleler: D og d, det siste er stumt CE, Ce, c. E og ce Antigene er proteinmolekyler på erytrocyttoverflaten Antall Rh. D antigener: 10. 000 20. 000 pr. erytrocytt Antistoff mot Rh antigener aktiverer ikke komplement, men fører til Fc reseptorbinding og fagocytose. • Antistoffer dannes først etter transfusjon eller svangerskap. Ig. G dominerer antistoffsvaret.

Stimulering av lymfocytter med mitogen Antigener og mitogener stimulerer lymfocytter til å gjennomgå en blastoid transformasjon

Blastoid transformasjon • Bare lymfocytter med en spesifikk reseptor for et antigen stimuleres av antigen – i praksis vil det være langt under 1 promille av cellene • Mitogener stimulerer imidlertid alle cellene i en gruppe lymfocytter – for eksempel B lymfocytter eller T lymfocytter

Zeta potensialet

Direkte anti globulin reaksjon • Et kanin antistoff rettet mot humant immunglobulin kan påvise humant immunglobulin som har seg festet til blodlegemer in vivo. Kanin antistoffet bygger da bro over zetapotensialet. • Problem: – blodlegemene er omgitt av plasma som inneholder store mengder med immunglobulin – for å kunne påvise humant antistoff på blodlegemene, må immunglobulinet i plasma vaskes bort. Ellers vil det løselige immunglobulinet nøytralisere kanin antistoffet – skyldes en negativ reaksjon dårlig vask?

Direkte anti globulin reaksjon

Kontroll av anti globulin reaksjoner • Alle negative prøver tilsettes 1 dråpe ”antistoffdekkete kontrollceller” som er Rh. D positive vaskete blodlegemer dekket med anti Rh. D • Ved riktig vask av negative prøver, vil de tilsatte antistoffdekkete kontrollcellene agglutinere

Direkte anti globulin reaksjon • Antistoffer mot egne blodlegemer finnes – hos nyfødte/fostre der mor har allo antistoffer rettet mot barnets blodtypeantigener. Bare antistoffer av Ig. G type passerer placenta – ved autoantistoffer mot erytrocytter – etter uforlikelige transfusjoner

Hemolyttisk sykdom hos foster eller nyfødte • Anti Rh. D fra mor kan føre til alvorlig anemi og høy bilirubin (dvs. hemolyttisk sykdom el. erytroblastose) hos nyfødte som er Rh. D positive. • Hos fostere vil bilirubin fjernes via placenta, og sykdommen gir seg uttrykk ved anemi. Etter fødselen utvikles også icterus. • Behandling av alvorlig hemolyttisk sykdom er: – Etter fødselen: IVIg; evt. utskiftningstransfusjon der barnet tilføres Rh. D negative blodlegemer i AB plasma. Man skifter vanligvis ut 2 x barnets blodvolum. – I svangerskapet: intrauterin transfusjon av konsentrerte erytrocytter. • Ved utskiftningstransfusjon: – Blodlegemer må være forlikelige med morens plasma – Plasma må være forlikelig med barnets blodlegemer

Indirekte anti globulin reaksjon Donor eller screening blodlegemer inkuberes med pasientens plasma ved 370 C i minst 30 minutter

Antistoffscreening • Ved antistoffscreening undersøkes om en pasient har irregulære blodtypeantistoffer • Pasientens plasma inkuberes med 2 4 nøye utvalgte blodlegemer av blodtype O. Disse uttrykker til sammen alle viktige blodtypeegenskaper i vår befolkning • Ig. M antistoffer gir direkte agglutinasjon • Ig. G antistoffer påvises oftest med anti globulin reaksjonen

Type and Screen • Blodtyping for ABO og Rh. D og samtidig antistoffscreening kalles ”type and screen” • Alle større sykehus utfører i dag ”type and screen” av pasienter som kan bli transfu sjonstrengende • Dermed kan pasienter med irregulære antistoffer oppdages og disse antistoffers spesifisitet bestemmes.

Forlikelighetsprøver • Forlikelighetsprøver ved transfusjon – Enkelt forlik påviser Ig. M antistoffer i pasientens plasma rettet mot givers blodlegemer, og settes opp ved romtemperatur • De vanligst påviste antistoffer er anti A og anti B pga. ABO uforlik og forbytting. De utløser umiddelbar komplementbetinget hemolyse av erytrocytter – Utvidet forlik med indirekte anti globulinreaksjon påviser Ig. G antistoffer i pasientens plasma rettet mot givers blodlegemer, og settes opp ved 370 C • De påviste antistoffer skyldes immunisering etter transfusjon eller svangerskap. De fører sjelden til komplementbetinget hemolyse av erytrocyttene, derimot utløser de fagocytose gjennom Fc reseptor binding

Praksis ved sykehus • Forliksprøveoppsett er avhengig av ”type and screen” resultat – Dersom ingen irregulære antistoffer er påvist • utføres det bare enkelt forlik før transfusjon (kontroll på ABO forlikelighet) – Dersom irregulære antistoffer er identifisert • velges blod som antistoffene ikke reagerer med (forlikelig blod), men det settes likevel opp både enkelt og utvidet forlik – Resultatet av antistoff screeningen er gyldig i 4 døgn; deretter må det tas ny prøve av pasienten

Valg av blodprodukter • Erytrocytter skal være forlikelige med pasientens plasma – Vi velger i utgangspunktet ABO og Rh(D) forlikelige blodlegemer • Dersom pasienten har fått påvist et irregulært alloantistoff, vil vi velge blodlegemer som ikke har det aktuelle antigen • Ved transfusjon av plasma, skal plasmaet være forlikelig med pasientens blodlegemer

Før transfusjon utføres • Enkelt forlik (siste ABO kontroll!) • Utvidet forlik, dersom antistoffscreening er positiv eller ikke er utført/er for gammel – Ved antistoffscreening undersøkes pasientens plasma på alloantistoffer av Ig. G type mot alle vanlig forkommende blodtypeantigener. Man foretar da såkalt ”type and screen”. – Dersom det ikke foreligger antistoffer mot disse antigener i en nylig gjennomført screening kan man gi blod uten å utføre utvidet forlik. • I akuttsituasjoner prioriteres enkelt forlik

ANTISTOFFSCREENING OG FORLIKELIGHETSPRØVER ANTISTOFFSCREENING Screening celle I Kontroll celle Screening celle II Kontroll celle (+ (+ el. -) Ris - +/- Aas + - +/- Pasient plasma FORLIKELIGHETSPRØVER Pasient Giver (plasma) (celler) Enkelt forlik ( + eller - ) Utvidet Forlik Kontroll Celler ( + el. - ) Konklusjon (forlikelig eller uforlikelig) Ris 1 - ja Ris 2 + nei Aas 3 - - +/- ja Aas 4 - - +/- ja Enkelt forlik settes opp med alle aktuelle givere. Utvidet forlik settes bare opp på pasienter som har irregulært antistoff, dvs. positivt resultat med screening celle I og/el. II. Vurder resultatene av screening, enkelt og utvidet forlik og trekk konklusjonen om undersøkelsen viser at blodet fra de oppgitte giverne er forlikelig eller uforlikelig. Det skal være mulig å finne minst en giver for hver av pasientene. Resultatene av dagens oppsett blir gjennomgått i smågrupper etter hvert som studentene er ferdige.

Problemer ved forlik • Enkelt forlik – Kuldeagglutininer – Pengeruller • Se om også pasientens blodlegemer er agglutinert. I så fall undersøk om agglutinat i forlik og pasientblodlegemer løses opp ved oppvarming (kuldeagglutininer) eller vask (pengeruller) • Utvidet forlik – Negativ reaksjon på grunn av dårlig vask

Blod er forlikelig • Når enkelt forlik er negativt – Positivt enkelt forlik pga. kuldeagglutininer eller pengeruller godkjennes som negativt, men transfusjon må evt. gis med oppvarmede blodlegemer ved kuldeagglutininer • Når utvidet forlik er negativt og tilsetting av antistoffdekkede kontrollblodlegemer gir partiell agglutinasjon

Hva gjør man på blodbanker i dag? • Type and screen – Pasienten blodtypes og undersøkes samtidig på irregulære blodtypeantistoffer. Antistoffundersøkelsen gjentas hvert 4. døgn under sykehusoppholdet. • Enkelt forlik • Utvidet forlik bare hos pasienter med irregulære blodtypeantistoffer • Elektronisk forlik kan erstatte enkelt forlik

Hvilke metoder benyttes på blodbanker i dag? • Enkelt og utvidet forlik settes ofte opp slik som dere har gjort – Anvendes spesialløsninger kan inkuberingstider kortes ned • Blodtyping og antistoffscreening utføres i Norge oftest med gelkort teknik

Gelkort teknikk • Reaksjonen foregår enten – I væskefasen over en gel og synliggjøres ved sentrifugering. Agglutinater blir liggende på geloverflaten, mens frie blodlegemer sentrifugeres ned i gelen. • eller – Ved at gelen er tilsatt antistoffer. Disse reagerer med aktuelle antigener og holder blodlegemene tilbake i de øvre lag av gelen. • Ved anti globulinreaksjon – Gelen er tilsatt anti globulinreagens. Antistoffer i plasma ”vaskes” vekk når blodlegmene sentrifugeres ned i gelen. Når blodlegemer med antistoffer på overflaten kommer ned i gelen agglutineres de derfor av anti globulinreagenset.

Gel-kort teknikk for påvisning av agglutinasjon 1. Tilsetting av røde blodlegemer til gel-brønnen 2. Inkubering (reaksjon med antistoff) 3. Sentrifugering 4. Avlesning Agglutinater er for store til å passere mellom gelkulene Positiv Negativ

Anvendelse av gel-kort teknikken Gel-kort teknikken kan benyttes til påvisning av agglutinasjon ved ulike problemstillinger og trenger ingen vasking: • Blodtyping (som vist med ABO/Rh. D typingen nedenfor) • Antisoffpåvisning (antistoff-screening og utvidet forlik) • Direkte anti-globulin test Partiell agglutinasjon er lett å påvise i gel-kort teknikk Partiell Positiv Negativ O Rh. Dpos 4+ 3+ 2+ 1+ B Rh. Dneg ABO/Rh. D typing

Antistoffscreening Anti globulinreagens i gelen Screeningcelle I+II Anti globulinreagens i gelen Screeningcelle III+IV