ONDOKUZ MAYIS NVERSTES ZRAAT FAKLTES TARIMSAL BYOTEKNOLOJ ANABLM

ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ ZİRAAT FAKÜLTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI GENOMİKLER DERSİ Tarımsal Biyoteknolojide Mobil Genetik Elementlerin Moleküler Markör Olarak Kullanılması Fahrettin YAZAL 1

1. GİRİŞ Transpozonlar: bir hücrenin genomunda farklı yerlere, transpozisyon olarak adlandırılan bir süreçle hareket edebilen DNA dizileridir. Bu süreç ile mutasyonlara ve genomdaki DNA miktarının değişmesine neden olurlar. 2

Transpozon elementleri genom içersinde konumlarını değiştirebilen tekrar dizileridir. Transpozon elementleri bolluğu ve polimorfizmleri bazı moleküler markör sınıfları geliştirmek için kullanılmış ve bunların çoğu TE insersiyon bölgelerini kullanmaktadır. 3

2. Bitkilerde Moleküler Markör Yaklaşımları Mutasyonlar ve genetik rekombinasyon gibi kalıtsal materyal değişiklikleri bir popülasyon içersindeki genetik çeşitliliğe katkıda bulunmaktadır. Son yıllarda DNA dizisinde herhangibir değişiklik olmadan genlerin ekspresyonundaki değişiklikleri de varyasyon üzerinde önemli faktör olduğu belirlenmiştir. 4

2. 1. Transpozon temelli moleküler markörler • Transpozonlar, özellikle de uzun bitiş tekrarları (LTR) retrotranspozonlar, bitki genomlarının yüksek bir yüzdesini oluştururlar. ’’Kes-yapıştır’’ mekanizmasından dolayı retrotranspozonlar; RNA ara aşaması ile bir genomda farklı yerlere girebilir ve mutasyonlara sebep olabilir. 5

2. 1. 1. Ters dizilim etiketli tekrar (ISTR) ISTR metodu seçici PZR amplifikasyonuna dayanan çok lokuslu bir markör sistemidir. Bu metotta, primerler genomda dağılmış olan yüksek kopyalı bir DNA dizisinden dış yöne doğru getirilmiştir. 6

ISTR primerlerinin amplifikasyon ürünleri jelde çözülür ve stoklarda depolanır. İlk olarak ISTR primerleri Hindistan cevizi retrotranspozunundan geliştirilmiştir. 7

2. 1. 2. Dizilim-spesifik çoğaltılmış polimorfizm (S -SAP) S-SAP dominant ve mültipleks bir markör sistemidir. İlk retrotrasnpozon-temelli moleküler markördür ve Çoğaltılmış Parça Uzunluğu Polimorfizm marköründen modifiye edilmiştir. 8

SAP’da genomik DNA ilk olarak iki restriksiyon endonükleaz ile kesilir ve daha sonra kesim enzilerine spesifik adaptörler yapıştırılır. Template adaptörlerde bulunan dizilerden geliştirilen primerler ile ön amplifikasyona tabi tutulur ve sonra da bire bir LTR’nin korunan bölgesinden çoğaltılan adaptör primeri olan iki primer çoğaltılır. 9

2. 1. 3. Rertrotranspozon-temelli polimorfizm (RBIP) insersiyonel RBIP mültiples, S-SAP mültipleksine bir altarnatif olarak düşünülmüştür. RBIP’in önemli bir avantajı Taq. Man veya DNA chip teknolojisi gibi jel kullanılmayan işlemlerle çalışılan örnek miktarının kolayca arttırılması için kullanılır. 10

2. 1. 4. Retrotranspozon-arası polimorfizm (IRAP) çoğaltılmış IRAP çok lokuslu dominant bir tekniktir. Bu teknik ilk olarak BARE-I dizisi kullanılarak geliştirilmiştir. 11

IRAP korunan LTR dizilerinden dışarıya doğru bir yönde geliştirilen PZR primerleri ile kullanılır. İki LTR arasındaki veya yalnız LTR’ler arasındaki iç bölgeler çoğaltılır. 12

2. 1. 5. Retrotranspozon-mikrosatellit çoğaltılış polimorfizm (REMAP) • REMAP da bir dominant ve mültipleks markör sistemi olup; IRAP’a benzemekterdir, fakat REMAP bir LTR primeri yakınındaki bir mikrasatellite spesifik bir primer kullanmaktadır. 13

Basit dizilim tekrarları olarak bilenen mikrosatalitler bitki ve hayvanlarda bulunan bir tekrarlanan dizi tipidir. 14

2. 1. 6. SINE-arası (ISAP) çoğaltılmış polimorfizm ISAP komşu SINE kopyaları arasında PZR ile genomik DNA çoğaltımına ve ortaya çıkan amplikonların sonrasında elektroforez ile ayrılmasına dayanır. 15

İleri primer 3’ ucuna doğrudur, geri primer ise 5’ ucuna bakmaktadır. PZR ürünleri agarozjel elektroforezi ile ayrılmaktadır. 16

2. 1. 7. RAPD-retrotranspozon polimorfizm (R-RAP) çoğaltılmış R-RAP bazı sınırları olan RAPD ve IRAP tekniklerinin bir kombinasyonu olarak tasarlanmıştır. 17

RAPD’de düşük tekrarlanabilirlik bir problem iken, IRAP’ta primer bağlanma bölgeleri amplikon ürününü üretemeyecek kadar uzak olabilir. DNA örnekleri 10 bazlık rastgele bir primer ile bir LTR primeri kullanılarak çoğaltılır. 18

2. 1. 8. Gen retrokopya polimorphizmi (GRIP) insersiyon Bir veya daha fazla bireyde bir retrotranpozon olmuş insersiyon olarak mevcut olan, fakat referans genomda bulunmayan işlenmiş bir gen transkripti GRIP olarak adlandırılır. 19

İşlenmiş m. RNA’ların genomda dağılmış insersiyon olan insanlar, fareler ve şenpazelerde devam eden bir mutasyon mekanizmasıdır ve tümörlerde bulunabilirler. 20

3. Yüksek Çıktılı Teknolojiler İle Mobil Genetik Markörinin Tespit Edilmesi . p. MEI (mobil element insersiyonu) profilleme tüm genom seviyesinde iki gruba ayrılabilir: hedefli metotlar ve sekanslama sonrası biyoinformatik metotlar. Sekanslama veya genotiplemeden önce; MEI ile ilişkili DNA parçaları hedeflenen metotlarda deneysel olarak zenginleştirilir. Ayrıca sekanslama sonrası biyoinformatik metotlar halinde genom sekanslama verisini olarak tanımlanır. 21

4. Biyoinformatik ve Mobil Genetil Element Analizleri Son zamanlarda, dizilenmiş olan genomlardaki transpozon elementler (TE)’lerin ortaya konması için bazı biyoinformatik yazılımlar geliştirilmişse de, genomboyu yaklaşımlar kullanarak aktif TE’lerin belirlenmesine adanmış çok az hesaplama aracı bulunmaktadır. 22

5. Geçmişten Çalışmaları Günümüze Mobilom Çok sayıda bitki genomunun sekanslaması ile tüm genom dublikasyonu ve TE’lerin angiosperm genomlarının organizasyonu üzerindeki etkileri daha iyi anlaşılmıştır. 23

6. Transpozonların ve Transpozon Temelli Markörlerin Diğer Kullanım Alanları Biyoçeşitlilik Flogenetik Bağlantı haritalaması ve fonksiyonel genomik Moleküler ekoloji 24

Teşekkür Ederim 25

Sorular • 1. transpozon temelli maktörlerden 3 tanesini yazıp S-SAP’ı anlatınız? IRAP. R-RAP. REMAP. ISTR. SİNE. S-SAP: SAP’da genomik DNA ilk olarak iki restriksiyon endonükleaz ile kesilir ve daha sonra kesim enzilerine spesifik adaptörler yapıştırılır. Template adaptörlerde bulunan dizilerden geliştirilen primerler ile ön amplifikasyona tabi tutulur ve sonra da bire bir LTR’nin korunan bölgesinden çoğaltılan adaptör primeri olan iki primer çoğaltılır. 2. RAPD ve IRAP’ta karşılan sorunlar nelerdir yazınız. RAPD’de düşük tekrarlanabilirlik bir problem iken, IRAP’ta primer bağlanma bölgeleri amplikon ürününü üretemeyecek kadar uzak olabilir. 26

• 3. Basit dizilim tekrarları olarak bilenen ………………. bitki ve hayvanlarda bulunan bir tekrarlanan dizi tipidir. (mikrosatalitler) 4. Bir hücrenin genomunda farklı yerlere, transpozisyon olarak adlandırılan bir süreçle hareket edebilen DNA dizilerine ………………. denir. (transpozon) 27