ONCOLOGIA SPERIMENTALE DI LABORATORIO S BENINATI Transgenesi E

ONCOLOGIA SPERIMENTALE DI LABORATORIO S. BENINATI

Transgenesi E’ un processo attraverso il quale è possibile inserire del DNA esogeno, transgene, all'interno di cellule vegetali o animali L’animale si definisce transgenico quando il gene esterno è: integrato nel suo genoma espresso correttamente e selettivamente in uno o più tessuti dell'animale integrato nella linea germinale e per conseguenza trasmissibile dall’animale fondatore alla progenie. S. Beninati

PERCHE CREARE ANIMALI TRANSGENICI? Per il miglioramento delle prestazioni produttive degli animali Per il miglioramento della qualità dei prodotti Per aumentare la resistenza degli animali alle malattie Per la produzione di proteine di importanza farmaceutica Per creare modelli animali per lo studio delle malattie nell’uomo Per fornire organi per xenotrapianti nell’uomo S. Beninati

COME SI OTTENGONO? Metodi per l'inserimento del DNA esogeno in cellule animali sono: Microiniezione di DNA ricombinante nel pronucleo maschile dello zigote La microiniezione di cellule staminale nell’ovocita fertilizzato Trasferimento del nucleo di cellule staminali trasformate in vitro in oociti anucleati Transgenesi mediata da retrovirus Transgenesi mediata da spermatozoi S. Beninati

Microiniezione di DNA Solo sul topo da buoni risultati. Si fa una microiniezione di DNA ricombinante nel pronucleomaschile dello zigote Prelevamento degli zigoti della femmina con microiniezione del transgene Impianto degli embrioni a due cellule in una pseudo-madre sottoposta a trattamento ormonale Con questo sistema circa il 10% degli animali nati è transgenico. S. Beninati Pronucleo femminile Ovulo fertilizzato Pipetta di fissaggio Pronucleo maschile Pipetta di iniezione Transgene Ovulo fertilizzato Femmina che ha subito l’impianto Fondatore transgenico

Microiniezione di cellule staminali Utilizzo di cellule staminali ricavate dalla blastociste murine Coltivazione di queste e successiva transfettazione con il gene di interesse Reintroduzione cellule per microiniezione in blastociste derivate da un altro topo, Sviluppo di embrioni parzialmente transgenici, e loro introduzione in madri pseudogravide Identificazione di un animale nel quale il transgene sia presente nella linea germinale Coltura Blastocisti donatrice Massa cellulare interna Cellule ES Transgene Transfezione Cellule ES Arricchimento in cellule ES transfettate Microiniezione nella blastocisti Blastocisti ricevente Impianto Fondatore transgenico S. Beninati

Trasferimento del nucleo di cellule staminali Prevede l'utilizzo della tecnica di clonazione Coltivazione di cellule staminali e successiva transfettazione con il gene di interesse I. C. M. Transfezione Microiniezione dei nuclei delle cellule in un ovocita anucleato Esone Selezione cellule Pipetta L’introduzione del nucleo darà origine a un embrione, che è poi impiantato in una madre pseudogravida Si ottiene un animale transgenico nel cento per cento dei casi Ovulo Enucleazione Nuclei purificati Nucleo Fusione attivazione Coltura embrione in vitro Impianto Efficienza estremamente bassa Introne Neo S. Beninati Topo transgenico

Transgenesi mediata da retrovirus Gli embrioni vengono infettati con un retrovirus reso non patogeno e con alcune delle sue componenti sostituite con il gene di interesse L'embrione infettato viene quindi impiantato nella madre che darà poi origine alla prole Femmina donatrice Embrione a 8 cellule Retrovirus Transgene Rischi: Possibilità di generare nuovi virus patogeni Reazioni immunitarie Femmina che ha subito l’impianto Fondatore transgenico S. Beninati

Transgenesi mediata da spermatozoi Gli spermatozoi si legano spontaneamente con molecole di DNA esogeno e lo trasferiscono agli embrioni durante la fecondazione La prole è poi selezionata sulla base dell’analisi del DNA estratto da un frammento di coda o di orecchio. Questo metodo è stato associato all’ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection) Con questo sistema sono stati ottenuti topi transgenici ad alta efficienza. S. Beninati

Transgenesi mediata da spermatozoi Interazione spermatozoi/DNA Fecondazione in vitro Fecondazione esterna Fecondazione artificiale Sviluppo esterno Progenie transgenica Impianto embrioni 2 cellule in pseudogravide S. Beninati

Xenotrapianti Esperienza molto limitata di trapianti xenogenici di organi o tessuti in riceventi umani : Anni ‘ 70: sopravvivenza per nove mesi di un rene di scimpanzé trapiantato in un ricevente umano Anni ‘ 80: trapianto di un cuore di babbuino in una bambina che sopravvisse per poche settimane Anni ‘ 90: due fegati di babbuino furono trapiantati in due pazienti: sopravvissero l'uno per settanta giorni e l'altro per ventisei giorni Tentati trapianti di cuore (tre casi) o di fegato (un caso) di maiale; in nessun caso il paziente sopravvisse più di ventiquattro ore. S. Beninati

Xenotrapianti Sono 4 gli ostacoli immunologici da superare: Rigetto iperacuto (ant. xenoreattivi vs cellule endoteliali) Rigetto acuto vascolare (ant. Xenoreativi + natural killer + monociti att. Cellule endoteliali infiamamzione, trombosi e rigetto) Rigetto mediato dalle cellule T Rigetto cronico dello xenotrapianto (proliferazione cellule muscolari lisce obliterazione vasi sanguigni) S. Beninati

Trasmissione di agenti infettivi Identificati oltre 60 agenti infettivi del maiale, con la potenziale capacità di causare malattie nell'uomo Adottate misure di controllo: parto dei maiali mediante isterotomia controllo accurato dell'ambiente sorveglianza routinaria dei maiali e del personale che li cura Esclusi quasi tutti gli agenti infettivi noti, che destano preoccupazione Non si puo esculdere presenza di virus che non provocano alcuna patalogia nel maiale ma patogeni per l’uomo S. Beninati

ASPETTI ANTROPOLOGICI ED ETICI In aggiunta ai problemi connessi ci sono tre questioni che richiedano di essere affrontate: L'accettabilità dell'intervento dell'uomo sull'ordine del creato La praticabilità etica di tale tecnica L'eventuale impatto sulla psiche umana S. Beninati

L'accettabilità dell'intervento dell'uomo sull'ordine del creato Posizione della Chiesa cattolica: Uomo al centro e al culmine del creato collabora con il Creatore per raggiungere la perfezione finale del creato Quindi Dio affida all’uomo il dominio del creato in Suo nome L’uomo riflette l’azione stessa del Creatore dell’universo Questo non vuol dire che l’uomo deve spadroneggiare sulle altre creature ma le deve orientare verso l’autentico e integrale bene dell’uomo S. Beninati

La praticabilità etica di tale tecnica Sono 2 i problemi di natura etica Uso degli animali per migliorare la sopravvivenza dell'uomo l'animale e l'uomo abbiano una dignità equivalente Uomo tiranno animali siano del tutto in balia dell'arbitrio umano Nessuna limitazione etica Accettabilità del superamento della barriera tra specie animale e specie uomo Identita personale non viene intaccata Rispetto esigenze etiche Rimane solo l’aspetto culturale psicologico S. Beninati

L'eventuale impatto sulla psiche umana L'identità personale e’ la singolarità e irriducibilità dell'uomo in rapporto al suo essere e al suo sentirsi persona Allora l'identità personale costituisce un bene della persona Limite etico nel caso che esso eventualmente comportasse modifiche per l'identità della persona che lo riceve. Avremo 2 tipi di organi: quelli meramente funzionali e quelli con maggiore valenza personalizzante Questi dovranno essere valutati, caso per caso, proprio in funzione della carica simbolica che vengono ad assumere nella singola persona S. Beninati