Oligonukleotid szintzis Mintegy 50 ves mlt 5 klnbz

Oligonukleotid szintézis Mintegy 50 éves múlt 5 különböző kémia: foszfáttriészter, fosztittriészter, foszfátdiészter Foszforamidit, H-foszfonát Szilárd fázisú szintézis: hordozó: controlled pore glass (CPG), vagy polisztirol Mind DNS mind RNS szintetizálható mind a két módszerrel

Oligonukleotid szintézis: monomerek

Oligonukleotid szintézis: foszforamidit módszer B 1 di-Me. O Tr O O O B 1 O 2% DCA/DCM O O Ac. O HO O di-Me. O Tr hordozó O < 1 % Ac 2 O B 1 O HO B 2 O di-Me. O Tr újabb ciklus O O tetrazol O hordozó N O NC O P N > 99 % B 2 O di-Me. O Tr O I 2 / H 2 O O O P O O di-Me. O Tr O O B 1 O NC O O P O O O hordozó O O

Oligonukleotid szintézis: foszforamidit módszer, alternatív kép

Oligonukleotid szintézis: H-FOSZFONÁT MÓDSZER Előny: az oxidációt elég a végén elvégezni, vagy – igény szerint – el sem kell töltés nélküli molekula Könnyebben átmegy a sejtfalon/membránon

Egy-két automata szintetizátor

OLIGONUKLEOTIDOK UTÓKEZELÉSE I. - Deblokkolás: védőcsoportok eltávolítása, hordozóról való lehasítás A lúg hatására lehasad: - védőcsoportok a bázisokról - -cianoetil csoport a fosztátról - oligo a hordozóról - liofilezés, sómentesítés

OLIGONUKLEOTIDOK UTÓKEZELÉSE II. - méret szerinti elválasztás, PAGE, vagy HPLC (sokszor nem szükséges) Ioncserés kromatográfia - kvantitálás bázis d. A d. G d. C d. T átlagosan Hidrofób kromatográfia a DMT csoporton keresztül e(µmol * cm/cm 3) 15. 4 11. 7 7. 5 8. 8 e = 10 (µmol * cm)/cm 3

OLIGONUKLEOTIDOK: FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEK - primerek: DNS, RNS szekvenálás, PCR, mutagenezis - linkerek: mesterséges hasítóhelyek bevitele - adapterek: különböző (nem-kompatibilis) ragadós DNS végek összekötése, esetleg hasítóhely bevitelével - hibridizációs próbák, DNS diagnosztika - antiszensz oligonukleotidok, génterápia gén darabok egyéb, pl. DNS affinitásoszlopok készítése, stb.

Linkerek rövid, önkomplemeter oligonukleotidok, amelyek saját magukhoz hibridizálva olyan tompa végű, kettősszálú DNS-t képeznek, amely tartalmazza egy tetszőleges restrikciós endukleáz felismerő helyét: Restrikciós hely bevitelére alkalmas Bam. HI. . . CGGATCCG Eco. RI. . . GGAATTCC Pst. I. . . GCTGCAGC ADAPTEREK szintetikus kettősszálú oligonukleotidok, amelyek végei kompatibilisek különböző restrikciós endukleázokkal végzett emésztések során képződő végekkel. Esetenként valamilyen restrikciós endonukleáz felismerőhelyét tartalmazhatja. Rövid adapterek: egyik vég ragadós, a másik tompa. Eco. RI – Sma. I. . . 5'AATTCCCGGG 3‘ 3’GGGCCC 5’ Sma. I Hosszú adapterek: két ragadós vég között egy harmadik restrikiós endonukleáz felismerõhelye pl. Bam. HI (Apa. I) Sac. I 5' GATCCGGGCCCTGTTAGAGCT 3' 3' GCCCGGGACAATC 5'

Primerek szintetikus oligodeoxinukleotidok, amelyek iniciációs pontjaiként szolgálnak a templát függő DNS polimerázok számára. Univerzális primerek: a gyakorlatban elterjedt vektorok klónozó helyének környékére tervezett primerek. Specifikus primerek: az adott feladatnak megfelelően szintetizált speciális szekvenciájú oligonukleotidok.

Polimeráz láncreakció I. Termostabil DNS polimeráz, Taq, Pfu, Vent, Pwo stb. Soknak nincs 3’ 5’ exonukleáz aktivitása “A” túlnyúló

Polimeráz láncreakció II.

A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ MÓDOZATAI - belső PCR, specificitás növelése belső primerek használatával egy elsődleges PCR terméken - egy specifikus primert használó PCR + primer adapter limitált információ esetén - LM PCR, ligálás közvetített PCR, kromoszóma metiláltsági térképezésére - inverz PCR, szegélyező szekvenciák izolálására - “farkazott PCR” ld. c. DNS izolálás - RT PCR, reverz transzkripció kapcsolt PCR, ld. c. DNS - kvantitatív PCR, m. RNS mennyiségének becslésére

A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI klónozás, megfelelő DNS szakaszok kinyerése, esetenként degenerált primerekkel DNS szekvenálás, pl. Thermo. Sequenase mutagenezis szálspecifikus próbák előállítása diagnosztika fertőzések kimutatására mutáns allélek kimutása

BELSŐ (NESTED) PCR 1. PCR 2 primer párt használunk nagyobb specificitás, a nemspecifikus termékek eltűnése költségesebb

EGY SPECIFIKUS PRIMEREN ALAPULÓ PCR 'A' GÉN hasítás 'A' enzimmel 'A' GÉN 'A' ligálás primer/adapterrel GÉN 'A' PCR 'A' Potenciális melléktermék: 'A' elkerülésére megoldás: a primer adaptor feleslegben való alkalmazása

LM PCR, ligálás közvetített PCR, kromoszóma metiláltsági térképezésére 'A' GÉN hasítás 'A' enzimmel 'A' GÉN 'A' ligálás primer/adapterrel GÉN 'A' PCR 'A' ha “A” metiláció érzékeny nincs termék ha “A” izoskizomerje érzéketlen metilációra van termék

INVERZ PCR A géneket környező régiók kiamplifikálkására Általában a gén szekvenciája részben vagy teljesen ismert primer pár tervezhető A A A hasítás 'A' restrikciós enzimmel önligálás A PCR 'A' A

REVERZ TRANSZKRIPCIÓ KAPCSOLT PCR (RT-PCR) antiszensz primer m. RNS reverz transzkripció reverz transzkriptázzal AMV: avian mieloblastosis virus RT MMLV: Moloney murine leukémia vírus RT Tth: Thermus thermophilus, Mn 2+ jelenlétében c. DNS szensz primer PCR Gének szerveződésének 1000 vizsgálatára 750 500 250 bp RT+ RT- g. K

REVERZ TRANSZKRIPCIÓ KAPCSOLT KVANTITATÍV PCR Az RNS preparátumnak DNS mentesnek kell lennie termék plató lineráris szakasz exponenciális rész ciklus szám Hagyományos PCR-rel igen nehéz a termék mennyiségének a meghatározása

Real-time PCR T 95°C 72°C 50°C Denaturálás : SYBRGreen. I Hibiridizáció DNA szintézis : fluorescens SYBRGreen. I Denaturálás

Real-time PCR reakció analízise Kalibráció ismert mennyiségű genomiális DNS-sel reprodukálhatóság ismeretlen mennyiségű templát c. DNA-sel. g. DNA: 280 ng 28 ng 2. 8 ng 0. 28 ng 0. 028 ng

A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI: klónozás

A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI: DNS szekvenálás templát DNS dd. ATP/d. NTP PCR egy primerrel dd. A terminálódott láncok száma lineárisan sokszorozódik

A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI: mutagenezis random: a Taq polimeráz átírási hűsége rosszabb, hibák épülnek be és amplifikálódnak 1 -2 hiba 1 kb hosszon Mn 2+ vagy nukleotid analógok (inozin) növelik a mutációs rátát in vitro evolúció irányított: O 1 Mf Xho. I Bam. HI O 2 Mr O 1 -Mr 1 st PCR-s Mf –O 2 O 1 Bam. HI Xho. I CO 2 2 nd PCR O 1 – O 2 Bam. HI Xho. I digest with Xho. I and Bam. HI ligate into Xho. I – Bam. HI digested vector

A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI I. - FERTŐZÉSEK KIMUTATÁSA minden élőlény genetikai anyaga nukleinsav, ez tartalmaz specifikus szekvenciaelemeket speciálisan tervezett primerek segítségével PCR a termék megjelenése fertőzésre utal

A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI II. MUTÁCIÓK KIMUTATÁSA normális A C mutáns 5' 3' gén 5 ' A 3' C PCR nincs termék egészséges 5 ' beteg 5 ' C 3' A 3' C PCR nincs termék beteg egészséges

Diagnosztika optimalizálás 60 o. C R 62 o. C +C 64 o. C R +C 66 o. C R M +C R Bam. HI Xho. I

Ligáz láncreakció denaturáció, hibridizáció A 5’ 3’ T 5’ 5’ A 3’ T 3’ ligálás, termostabil ligázzal 5’ 5’ T 5’ 5’ A 3’ T 5’ 3’ 3’ T 5’ 5’ A 3’ T 3’ 3’ 3’ A 4 primeres, A PCR-t nem tudta kiszorítani 5’ A 3’ denaturáció, hibridizáció 3’ 5’ T A 5’ 3’ 5’ T 5’ A 3’ 3’ ligálás, termostabil ligázzal 5’ 3’ A 3’ 3’ T 5’ 5’ A 3’ T 5’

Ligálás és a PCR kombinálása

GÉNSZINTÉZIS STRATÉGIÁK 1. Szintetikus DNS fragmentek összeállítása átfedő oligomerekből 1. fragment 2. fragment 1+2. fragment 3. fragment 1+2+3. fragment hátrány: drága, mind a két szálat meg kell szintetizálni

2. Fragment összeállítás primer-templát módszerrel 5’ 3’ 3’ 5’ Klenow, d. NTP 5’ 3’ 3’ 5’ Több verzió is erre az enzimatikus feltöltési elvre alapszik. 2. a. Hajtű módszer 5’ 3’ Klenow, d. NTP emésztés restrikciós endonuklázokkal ligálás

Híd ligálás 2. c. Fragment összeállítás a javító mechanizmus (gap repair) kihasználásával 5’ 3’ 3’ 5’ átfedő szintetikus oligonukleotidok hasított vektor polimerizáció Klenow, d. NTP ligálás transzformálás hibridizálás, enzimatikus feltöltés 5’ 3’ 3’ 5’ közvetlen transzformálás

A humán szérum albumin HSA szintézise 1864 bp hosszú géne, 60 k. Da méretű fehérje. Magyar projekt, svéd megbízásból SZBK, Biotechnika Rt. 5 kutatója Eleinte még manuális oligo szintézis A szintézis oka: élesztőben termeltetni vérpótló szer A gént négy kb egyenlő részre osztottál, mindegyik kb 450 bp hosszú, Ezeket klasszikus klónozással illesztették össze 5’ 3’ minden darabot 40 -50 bp-os oligokból illesztettek össze

Negyed HSA szintézis stragégiája p. N p. C G CTTAAOH CCCGGG Apa. I-Eco. RI ligálás adapter AATTC GGGCCC G G CCCGGG CTTAAOH GGGCC HSA 1 p. N G CCTAG GGATCN CCTAGN GGGCCC CCCGGG HSA 2 AATTC G 1. ligálás 2. tompítás 3. ligálás HSA 1 p. N ligálás p. N G AATTC CTTAA G Eco. RI-Apa. I hasítás GGATCN CCTAGN HSA 1 GGGCCC C AATTC G 1. ligálás 2. tompítás 3. ligálás GGATCN CCTAGN HSA 1 G C HSA 2 GGGCCC CCCGGG GGGCC G AATTC CTTAA G GGGCCC CCCGGG p. C CCCGGG G CTTAAOH Apa. I-Eco. RI adapter G CTTAAOH