Ogni proteina posso clonarla in infiniti modi Come

Ogni proteina posso clonarla in infiniti modi: Come scelgo le sequenze a. a. da clonare? Su quali parametri posso basarmi per scegliere bene?

Scelta delle sequenze da clonare ü Rational design: • Omologie di sequenze con proteine note • Identificazione di domini funzionali mediante predizioni di struttura 2 D e 3 D

Cloning Gene constructs design primers • Small, globular proteins (full length protein) • Larger and/or multi-domain proteins -full length protein -choose one or more domains (domains boundaries!) Well folded Most likely unfolded Use structure prediction and multiple sequence alignments to design shorter constructs not to cut secondary structure elements http: //bioinf. cs. ucl. ac. uk/psipred/

RICERCHE BIOINFORMATICHE ü SEQUENZA NUCLEOTIDICA Gene. Bank http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez Ensembl http: //www. ensembl. org/index. html ü SEQUENZA PROTEICA E INFORMAZIONI SULLA PROTEINA Swissprot website http: //www. ebi. ac. uk/swissprot/ Ex. PASy Proteomics Server http: //www. expasy. org/proteomics Uniprot http: //www. uniprot. org/ ü INFORMAZIONI SU SNPs (is a free public archive for genetic variation within and across different species) db. SNPs http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/SNP/ ü RICERCHE DI OMOLOGIE E DOMINI CONSERVATI BLAST http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/Blast. cgi? CMD=Web&PAGE_TYPE=Blast. Home Pfam http: //pfam. sanger. ac. uk/ SMART http: //smart. embl-heidelberg. de/

RUN BLAST

Pfam

Pfam

Pfam

http: //smart. emblheidelberg. de/smart/job_status. pl? jobid=150217145174205841319 494839 v. VWWz. Ood. NA

ü ALLINEAMENTI DI SEQUENZE Clustal. W http: //npsa-pbil. ibcp. fr/cgibin/npsa_automat. pl? page=npsa_clustalw. html ü INFORMAZIONI STRUTTURALI PDB http: //www. rcsb. org/pdb/home. do ü PREDIZIONE DI REGIONI TRANSMEMBRANA http: //www. sbc. su. se/~miklos/DAS/ http: //www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM-2. 0/, http: //www. ch. embnet. org/software/TMPRED/form. html ü PREDIZIONE DI SEQUENZE SEGNALE http: //www. cbs. dtu. dk/services/Signal. P/ ü PREDIZIONI TOPOLOGICHE IUPRED http: //iupred. enzim. hu/ Fold. Index http: //bip. weizmann. ac. il/fldbin/findex

SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD http: //npsa-pbil. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl? page=npsa_sopma. html

TMHMM Server v. 2. 0 Prediction of transmembrane helices in proteins http: //www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM-2. 0/

PREDIZIONE DI SEQUENZE SEGNALE

LOOK FOR DISORDERED REGIONS IN THE SELECTED CONSTRUCT http: //bip. weizmann. ac. il/fldbin/findex

ü ALTRE ANALISI DI SEQUENZA Presenza di codoni rari http: //nihserver. mbi. ucla. edu/RACC N-end rule (Varshavsky, A. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 12142 -1214)

Il codice genetico or T

Rare codons (codon Bias) • The frequency of codons are different among different organisms • Codon analysis programs are available on line

Espressione di SOD 1 umana (HSOD) Amplificazione del gene SOD 1 da c. DNA umano via PCR Preparazione del vettore (plasmide) di espressione Inserimento del gene in vettore di espressione Trasformazione del vettore in ceppo di E. coli Screening delle colonie Coltura batterica Isolamento della proteina Purificazione Caratterizzazioni biofisiche preliminari

Amplificazione del gene SOD 1 Direct Primer Inizio seq. SOD trascritta Reverse Primer

Condizioni di reazione H 2 O sterile Buffer per Taq (10 x) d. NTPmix (10 m. M ognuno, 200 M ognuno fin) Templato (c. DNA genomico umano) Primer SODHInd. III (100 pmol/ l) Primer SODSal. I (100 pmol/ l) Taq polimerasi* 5 U/ l *Aggiungere la Taq alla fine Cicli 94 °C 55 °C 72 °C 15 °C 5’ 30’’ 60’’ 2’ 10’ O/N 30 cicli 36. 5 l 5. 0 l 1. 0 l 0. 5 l 50. 0 l

Purificazione prodotto PCR Il prodotto viene purificato con il QIAquick PCR purification kit (per purificazione di doppi o singoli prodotti di PCR da 100 bp a 10 kb) Il DNA si assorbe su specifiche membrane di gel di silice in presenza di alta concentrazione di sali, mentre i contaminanti passano attraverso la colonna. L’assorbimento del DNA su gel di silice dipende dal p. H ed è ottimale a p. H 7. 5 (tampone PB). Il lavaggio viene effettuato con una soluzione contenente etanolo (PE) che lava via sali e altri contaminanti L’eluizione viene fatta in condizioni basiche, a bassa forza ionica, con 10 m. M Tris p. H 8. 5. Bind Wash Elute

Protocollo di purificazione del frammento PCR