OBTENCIN Y EVALUACIN DE CEPAS NATIVAS DE Trichoderma

OBTENCIÓN Y EVALUACIÓN DE CEPAS NATIVAS DE Trichoderma spp. EN EL BIOCONTROL DE Botrytis cinerea EN EL CULTIVO DE ROSAS. David Arcos Plazas

Introducción La producción de rosas representa, en términos anuales, 2. 800 millones unidades. (El Universal, 2010) La Rosa, manejada tanto bajo invernadero como en un jardín doméstico, se ve afectada por un sinnúmero de enfermedades La agricultura tradicional demanda la utilización de productos químicos para el control de moho gis, mas aún poblaciones de la enfermedad muestra resistencia a productos como Carbendazim e Iprodione y una leve resistencia a Pyrimethanil, en las Provincias de Pichincha y Cotopaxi. Chamorro y Orellana (2005)

En los últimos años se ha investigado sobre el antagonista Trichoderma sp. que actúa como controlador biológico de Botrytis sp. Debido a la importancia de los cultivos de flores en el país, la magnitud de las pérdidas causadas por Botrytis sp. y la alta resistencia que este patógeno muestra a varios productos químicos, se hace necesario establecer un método de control biológico basado en la obtención del antagonista Trichoderma sp. nativo de los predios en estudio

Objetivos Objetivo General del Proyecto • Obtener y evaluar cepas de Trichoderma spp. nativas presentes en la florícola Flor. Machachi conjuntamente con el stock de cepas de IASA 1, para el control de Botrytis cinerea en el cultivo de rosas (Rosa sp. ).

Objetivos Específicos del proyecto • Aislar, purificar y conservar cepas de Trichoderma spp. de muestras del suelo de los diferentes invernaderos de la florícola Flor. Machachi. • Aislar, purificar y conservar cepas de Botrytis cinerea fitopatógenas de rosas de la florícola Flor. Machachi. • Establecer la capacidad antagónica de cepas de Trichoderma spp de la Florícola Flor. Machachi y IASA I en el control de Botrytis cinerea en condiciones de laboratorio. • Analizar el crecimiento diametral y su capacidad de conidiación de las cepas de Trichoderma spp. aislados de la florícola Flor. Machachi.

• Establecer la eficiencia de cepas de Trichoderma spp. nativas y de la colección del IASA I en el control de Botrytis cinerea bajo condiciones de invernadero. • Evaluar la eficiencia de cepas de Trichoderma spp. nativas y de la colección del IASA I, aplicadas en el campo para el control de Botrytis cinerea en poscosecha. • Determinar el porcentaje de botones exportados, los destinados al mercado local y aquellos considerados como no aptos para la venta • Analizar la relación costo beneficio de los tratamientos empleados para el control de Botrytis cinerea en el cultivo de rosa.

REVISIÓN DE LITERATURA Rosa planta arbustiva El tamaño, color, número de pétalos y sépalos están determinados por la variedad foliolos dispuestos en forma de plumas Figueroa y García, citados por Martínez y Moreno, 2008 • Temperatura: 17ºC a 25ºC, con una mínima de 15ºC durante la noche y una máxima de 28ºC durante el día • Humedad relativa: brotación de las yemas (80 -90%), posteriormente estabilizarla a valores del 70 -75%. • Suelo: ácido p. H de 5. 5 a 6. 5 (Figueroa y García, citado por Rodríguez y Flórez, 2006).

Problemas fitosanitarios Principales plagas Principales enfermedades Araña roja (Tetranychus urticae) Trips (Franklinela occidentalis) Pulgón (Macrosiphum rosae) Mildeo velloso (Peronospora sparsa) Moho gris (Botrytis cinerea) Mildeo polvoso (Sphaerotheca pannosa)

Botrytis cinerea Generalidades patógeno necrotrófico de plantas saprófito sobre tejidos de plantas muertas o en descomposición, también puede ser un patógeno de flores, tallos, bulbos y semillas (Chase, 2000) Los factores que aceleran la senescencia incrementar la susceptibilidad, mientras que los tratamientos que disminuyen la senescencia incrementar la resistencia (Elad, 1997) Formación de esclerosios Temperaturas 2º y 7ºC (Chase, 2000).

Morfología Produce gran cantidad de micelio gris y varios conidióforos largos y ramificados Cuyas células apicales redondeadas producen racimos de conidios ovoides, unicelulares, incoloros o de color gris Las colonias pueden ser de tipo micelial, esclerocial o esporulante (Figueroa y García, 2002)

Ciclo de vida de Botrytis sp. Tomado de: http: //www. agf. gov. bc. ca/ornamentals/publications/pesticide/disease/ Botrytis_cinerea. pdf

• Factores de crecimiento: muestra actividad a bajas temperaturas y se manifiesta en productos almacenados por mucho tiempo. • Humedad relativa: germinación de conidios 93 -100% esporulación del hongo comienza entre 70 y 100% (Rabón, • Temperatura: germinación de conidios entre 15 y 20ºC (Rabón, 2001) (Eden et al. 2002) Ciclo de infección de Botrytis sp. Fuente: Benito et al. , (2000).

Control cultural y químico Control Biológico • Evitar siembras densas • Solarización • Podas de sanidad y retirar restos de la plantación • Numerosos fungicidas preventivos entre los cuales se destacan clorotalonil, dicloran, maneb, mancozeb, thiram, captan, entre otros • El control biológico usando microorganismos antagonistas naturales ha sido estudiado, y algunos hongos y bacterias han sido demostrados como efectivos contra el moho gris. (Clavijo y Cruz, 1997).

Trichoderma spp. hongo imperfecto Conidioforos erectos o arrastrados, altamente ramificados Esporas de color verde y son liberados en grandes cantidades (Cook y Baker, 1989)

Control de hongos fitopatógenos con Trichoderma spp. Control de una gran gama de hongos fitopatógeno Otros efectos en los cultivos El método de control través de competencia y predación antibióticos produciendo una degradación de hifas (Cook y Baker, 1989).

MATERIALES Y MÉTODOS Muestreo: Laboratorio Campo • Laboratorio de Control Biológico de la Carrera de Ciencias Agropecuarias – IASA 1, Departamento de Ciencias de la Vida, de la E. S. P. E. • Finca FLORMACHACHI

Métodos Aislamiento de Trichoderma spp. Muestra de suelo, alícuota de 40 g en 60 ml de agua destilada La solución 10 -2 se lo inoculó en cajas de petri con medio selectivo (TSM + P) Las muestras se incubaron a 26°C durante 7 días

Purificación de cepas de Trichoderma spp. Se extrajo micelio con pequeñas porciones de agar de cada colonia que se identificó como Trichoderma se sembró con la ayuda de una asa de platino en cajas de petri que contuvieron PDA + banco de cepas de Trichoderma Las cepas de Trichoderma spp, purificadas se almacenados

Aislamiento y conservación de Botrytis cinerea Cámara húmeda barrido por las fructificaciones Conservación del patógeno Inoculación en cajas de petri con PDA y con medio agar agua (AA)

Pruebas de antagonismo entre Trichoderma spp. y Botrytis cinerea in vitro Trichoderma spp. y Botrytis cinerea. Se partió de cultivos puros con 7 días de crecimiento a 26ºC a c Se preparó una suspensión concentrada de esporas Transferencia en cajas de petri con PDA en posición opuesta a 1 cm del borde Se tomaron evaluaciones a las 48, 72 y 96 h se incubaron por 4 días, entre 22 – 25°C b Cepa 10 B a pruebas de antagonismo a las, a)48 h, b)72 h y c) 96 h

Formulación de Trichoderma spp. El arroz se remojó por una hora, luego se retiró el exceso de agua, se eliminaron las impurezas y se agregó 5 ml de aceite vegetal comestible por Kg de arroz más azúcar al 0, 5%, homogenizando la mezcla Se colocó 100 g de sustrato en fundas de polipropileno y se esterilizó. 10 – 30 ml de suspensión de esporas de Trichoderma (109 )y se inoculó en las fundas de polipropileno, agitó, homogenizó y se incubó por 7 días

Determinación de la concentración de esporas de Trichoderma spp. desarrolladas en el sustrato. Se tomó 1 g de sustrato y se diluyó en 90 ml de agua destilada estéril Conteo y determinación de la concentración Se tomó 10μl de la suspensión y se colocó en cámara de Neubauer

Trabajo en campo Evaluación de los bioformulados de Trichoderma spp. en campo. Evaluado las cepas promisorias para el control Las evaluaciones se realizaron basándose en la fenología del botón floral Aplicaciones por 4 semanas , una vez por semana Se aplicó en las camas de las variedad Amelia, Freedom y Engagemnt Se disolvió 22. 5 g de bioproducto en 20 litros de agua y 5 ml de Carrier Portador por tratamiento

Metodología para evaluar el viaje simulado y vida en florero de las rosas 50 tallos al azar de las variedades/tratamiento fungicida específico para el patógeno y se llevó a un cuarto frío por 5 días Las flores se dejaron por un tiempo de 10 días en florero

RESULTADOS Y DISCUSIONES Fase de laboratorio Aislamiento, Caracterización y conservación de Trichoderma sp. CEPA CÓDIGO PROCEDENCIA C 1 C 2 C 3 C 4 C 5 C 6 C 7 C 8 C 9 C 10 C 11 C 12 C 13 C 14 C 15 C 16 C 17 10 a 10 b 11 b 12 a 14 c 16 a 18 b 1 c 2 a 2 c 4 c 5 a 6 a 6 c 8 b 8 c Bloque 10 repetición a Bloque 10 repetición b Bloque 11 repetición b Bloque 12 repetición a Bloque 14 repetición c Bloque 16 repetición a Bloque 18 repetición b Bloque 1 repetición c Bloque 2 repetición a Bloque 2 repetición c Bloque 4 repetición c Bloque 5 repetición a Bloque 6 repetición c Bloque 8 repetición b Bloque 8 repetición c Procedencia de 17 cepas de Trichoderma spp. , aisladas del suelo cultivado con rosas de la Finca Flor. Macachi. IASA-Rumiñahui, Pichincha. 2010 Característica de los cultivos de las 17 cepas de Trichoderma spp. y una cepa de Botrytis cinerea aisladas en la Finca Flor. Machachi. IASA-Rumiñahui, Pichincha. 2010

a) Cepario de Trichoderma spp aislado en la Finca Flor. Machachi conservado en aceite de vaselina. b) Trichoderma sp Floraislado en la Finca Machachi conservado en suelo. c) Trichoderma sp aisalado en la Finca Flor. Machachi conservado en silica gel. IASA-Rumiñahui, Pichincha. 2010 a) Trichoderma sp cepa 2 c aislada de la finca Flor. Machachi 2010. b), c) y d) Trichoderma sp. Cepa 2 c refrescadas de los métodos de conservación: aceite de vaselina, suelo y silica gel respectivamente. IASA-Rumiñahui, Pichincha. 2010

Crecimiento diametral de 17 cepas de Trichoderma sp. nativas y 1 cepa de Trichoderma sp. proporcionada por el centro de investigaciones del IASA 1 Esquema que se recomienda usar para el registro de datos del crecimiento radial Análisis de varianza para el crecimiento diametral promedio de cepas de Trichoderma sp. para las evaluaciones a las 48, 72 y 96 horas. IASA-Rumiñahui, Pichincha. 2010 Fuentes de Variación total tratamientos error (cm) CV (%) GL 66 17 49 48 h 72 h 96 h 0. 49** 0. 09 3. 34 8. 95 4. 49** 0. 37 7. 75 7. 85 0. 31** 0. 05 8. 91 2. 54

10 10 a 10 b 11 b 12 a 14 c 16 a 18 b 1 c 2 a 2 c 4 c 5 a 6 a 6 c 8 b 8 c c 19 48 H 3. 43 4. 00 3. 26 3. 46 3. 30 3. 40 3. 55 2. 93 3. 29 2. 40 3. 32 3. 66 2. 84 3. 17 3. 42 3. 71 bcd a cdef bcde bcd ef bcdef g bcde abc f def bcd ab 3. 38 bcd 3. 39 bcd 72 H 4. 96 8. 83 8. 58 8. 85 7. 60 7. 67 8. 79 7. 70 8. 31 7. 55 5. 82 7. 80 8. 23 8. 08 9. 00 6. 46 8. 25 6. 98 g a ab a cd bcd abc cd fg bcd abc a ef abc de 7. 83 9. 00 9. 00 8. 71 9. 00 96 H b a a a a a 10 b 9 11 b 8 12 a 14 a 7 Centímetros (cm) Tratamiento 14 c 16 a 6 18 b 5 1 c 2 a 4 2 c 3 4 c 5 a 2 6 a 1 6 c 8 b 0 48 H 72 H Horas (H) 96 H 8 c c 19 Promedios de crecimiento diametral de cepas de Trichoderma spp. en centímetros, para las evaluaciones realizadas a las 48, 72 y 96 horas. IASA-Rumiñahui, Pichincha. 2010

Pruebas de antagonismo Trichoderma spp. vs Botrytis cinerea Análisis de Varianza para el crecimiento radial de 18 cepas de Trichoderma spp. en el control biológic in vitro de Botrytis cinerea. IASA-Rumiñahui, Pichincha. 2010 Esquema que se recomienda usar para el registro de datos del crecimiento de micelio antagonista – patógeno. Fuentes de Variación TOTAL TRATAMIENTOS ENTRE ANTAGONISTAS Cepa 14 c Cepa 11 b Cepa 8 b Cepa 6 c Cepa 8 c Cepa 12 a Cepa 10 b Cepa 2 c Cepa 10 a Cepa 4 c Cepa 2 a Cepa 14 a Cepa 6 a Cepa 16 a Cepa 5 a Cepa 18 b Cepa C 19 ERROR CV (%) X (cm) GL 177 35 17 1 1 1 1 142 48 h 0. 650** 1. 140** 0. 000 ns 0. 100 ns 0. 360 ns 0. 004 ns 0. 230 ns 0. 040 ns 0. 400 ns 0. 020 ns 0. 120 ns 0. 000 ns 0. 530 ns 0. 001 ns 0. 960 ns 0. 001 ns 0. 020 ns 0. 140 ns 0. 400 ns 0. 040 9. 02 2. 19 72 h 0. 65** 1. 11** 7. 57** 12. 32** 12. 54** 15. 625** 13. 46** 12. 54** 13** 10. 82** 13. 46** 12. 251** 6. 889** 7. 06** 7. 744** 17. 42** 11. 025** 11. 66** 13. 23** 0. 05 4. 09 5. 58 96 h 0. 65** 0. 44** 23. 1** 28. 56** 28. 22** 38. 809** 31. 68** 32. 4** 24. 03** 24. 96** 27. 889** 19. 531** 25. 6** 28. 22** 30. 625** 34. 23** 34. 225** 29. 24** 28. 29** 29. 24** 0. 02 2. 11 7. 13

Prueba de Duncan al 5 %, para los promedios de crecimiento radiales cepas de Trichoderma spp. en centímetros, en dos direcciones, dirección hacia el patógeno (D 1) y su perpendicular (D 2). IASA-Rumiñahui, Pichincha. 2010 cepa 14 c 11 b 8 b 6 c 8 c 12 a 10 b 2 c distancia 48 h 72 h d 1 1. 78 a 4. 08 a 5. 34 a d 2 1. 78 a 5. 82 b 8. 38 b d 1 1. 86 a 4. 48 a 5. 28 a d 2 2. 06 a 6. 70 b 8. 66 b d 1 2. 34 a 4. 60 a 5. 64 a d 2 2. 72 b 6. 84 b b 9. 00 b d 1 2. 02 a 4. 62 a 5. 06 a d 2 2. 06 a 7. 12 b 9. 00 b 96 h 1 c d 1 2. 30 a 4. 86 a 5. 44 a d 2 2. 60 b 7. 18 b 9. 00 b d 1 1. 98 a 4. 74 a 5. 40 a d 2 2. 10 b 6. 98 b 9. 00 b d 1 2. 60 a 4. 94 a 5. 90 a d 2 3. 00 b 7. 22 b 9. 00 b d 1 2. 02 a 4. 40 a 5. 22 a d 2 2. 10 a 6. 48 b 8. 38 b 10ª 4 c 2 a 14 a 6 a 16 a 5 a 18 b c 19 d 1 1. 98 a 4. 70 a 5. 66 a d 2 2. 20 a 7. 02 b 9. 00 b d 1 2. 38 a 4. 33 a 5. 75 a d 2 2. 38 a 6. 80 b 8. 88 b d 1 2. 02 a 4. 50 a 5. 18 a d 2 2. 02 a 6. 16 b 8. 38 b d 1 1. 96 a 4. 54 a 5. 64 a d 2 2. 42 b 6. 22 b 9. 00 b d 1 2. 00 a 4. 24 a 5. 50 a d 2 2. 02 a 6. 00 b 9. 00 b d 1 1. 34 a 3. 36 a 5. 30 a d 2 1. 96 b 6. 30 b 9. 00 b d 1 1. 98 a 4. 72 a 5. 08 a d 2 2. 00 a 6. 82 b 8. 78 b d 1 2. 14 a 4. 38 a 5. 58 a d 2 2. 06 a 6. 54 b 9. 00 b d 1 2. 18 a 4. 50 a 5. 18 a d 2 2. 42 a 6. 80 b 8. 56 b d 1 d 2 2. 80 a 3. 2 b 4. 64 a 6. 94 b 5. 48 a 8. 9 b

Prueba de antagonismo de Trichoderma spp. Cepa 12 a, frente a Botrytis cinerea, IASA Rumiñahui, Pichincha. 2010

Resumen de aplicación para el control biológico in vitro, de Botrytis cinerea con Trichoderma spp. , a las 96 horas. Escala de clases de Bell et al. (1982) Esquema que se recomienda usar para el registro de datos del crecimiento de micelio antagonista – patógeno. Grado de conidiación de Trichoderma sp Escala de clases para formación de esclerocios de Botrytis cinerea Oleas (2010)

Análisis de varianza para el resumen de la aplicación de control biológico in vitro de Botrytis cinerea con Trichoderma spp. a las 96 horas. IASA-Rumiñahui, Pichincha. 2010 Fuentes de Variación total tratamiento error x CV (%) GL 51 17 72 Avance (D 1) Trichoderma spp. Esporulación Índice Bell Esclerocios de Botrytis cinerea 2. 44** 0. 99 6. 11 cm 16. 26 441. 93** 196. 11 94. 13% 14. 88 1. 21** 0. 07 2. 08 13. 18 2. 25** 0. 21 2. 74 16. 8

Promedios de las variables evaluadas en el resumen de la aplicación de control biológico in vitro de Botrytis cinerea con Trichoderma spp. a las 96 horas. IASA-Rumiñahui, Pichincha. 2010 Cepa Crecimiento (D 1) Conidiación final CUADRO de Bell Grados de Esclerocios 10 a 6. 76 b 76. 00 c 1. 00 a 1. 70 b 10 b 8. 32 a 79. 2 bc 1. 40 b 1. 00 a 11 b 5. 92 bc 98. 20 a 2. 10 c 3. 00 de 12 a 5. 88 bc 99. 40 a 2. 50 d 4. 00 g 14 a 6. 56 bc 96. 60 ab 2. 00 c 2. 80 cde 14 c 5. 32 c 95. 60 ab 2. 50 d 2. 80 cde 16 a 5. 56 bc 100. 00 a 2. 50 d 2. 40 c 18 b 5. 58 bc 98. 40 a 2. 50 d 2. 80 cde 1 c 6. 22 bc 98. 80 a 2. 00 c 3. 70 fg 2 a 6. 18 bc 98. 00 a 2. 00 c 2. 60 cd 2 c 5. 96 bc 97. 80 a 2. 50 d 3. 10 de 4 c 5. 56 bc 96. 60 ab 2. 50 d 3. 00 de 5 a 6. 16 bc 68. 00 c 2. 80 cde 6 a 5. 66 bc 98. 80 a 2. 30 cd 3. 30 ef 6 c 5. 58 bc 99. 80 a 2. 50 d 2. 60 cd 8 b 6. 80 b 94. 80 ab 2. 00 c 3. 00 de 8 c 6. 26 bc 98. 60 a 2. 10 c 2. 40 c c 19 5. 72 bc 99. 80 a 1. 00 a 2. 40 c

Crecimiento final de las cepas de Trichoderma spp. en centímetros, en dirección al patógeno (D 1), a las 96 horas. IASA-Rumiñahui, Pichincha. 2010 Porcentaje de conidiación final de Trichoderma spp en las pruebas de control biológico de Botrytis cinerea a las 96 horas de incubación. IASA-Rumiñahui, Pichincha. 2010

Capacidad Antagónica de 18 cepas de Trichoderma spp. frente Botrytis cinerea según la escala Bell (1982) et al citada por Baker & Cook (1983) a las 96 horas de incubación. IASA-Rumiñahui, Pichincha. 2010 Grado de formación de esclerocios de Botrytis cinerea en las pruebas de antagonismo con Trichoderma spp. a las 96 horas de incubación. IASA-Rumiñahui, Pichincha. 2010

Crecimiento diametral de 17 cepas de Trichoderma sp. nativas y 1 cepa de Trichoderma sp. proporcionada por el Centro de Investigaciones IASA 1 en la prueba de sensibilidad frente a 6 botricidas Análisis de varianza para el promedio diametral de cepas de Trichoderma spp expuestos a 6 Botricidas en la prueba de sensibilidad en evaluaciones efectuadas a las 48, 72, 96, 120 y 192 horas. IASA-Rumiñahui, Pichincha. 2010 Fuentes de variación TOTAL Cepas Botricidas Cep. XBotr ERROR (cm) CV (%) GL 215 17 5 85 108 48 h 0. 18** 58. 34** 0. 15** 0. 01 0. 82 9. 71 72 h 0. 45** 306. 12** 0. 35** 0. 02 1. 87 8. 09 96 h 0. 46** 645. 54** 0. 36** 0. 07 2. 77 9. 62 120 h 0. 18** 759. 85** 0. 18** 0. 00 3. 07 0. 65 192 h 0. 84** 715. 73** 0. 81** 0. 02 3. 32 4. 46

Promedios generales que representan los promedios diametrales en centímetros provenientes de las pruebas de inocuidad Trichoderma sp. vs 6 Botricidas a las 48, 72, 96, 120 y 192 horas. IASA-Rumiñahui, Pichincha. 2010 10 a 10 b 48 h 0. 96 b 0. 80 fg 72 h 1. 86 ef 1. 90 de 96 h 2. 40 h 2. 54 gh 120 h 3. 00 e 192 h 3. 00 i 11 b 0. 75 g 1. 72 g 2. 59 fgh 3. 29 b 3. 70 ab 12 a 0. 64 hi 1. 70 g 2. 59 fgh 3. 28 b 3. 68 bc 14 a 0. 75 g 1. 63 gh 2. 60 fgh 3. 00 e 3. 34 fg 14 c 0. 69 h 1. 63 gh 2. 69 efg 3. 00 e 3. 44 ef 16 a 0. 81 efg 2. 07 b 2. 69 efg 3. 00 e 3. 29 gh 18 b 0. 69 h 1. 54 h 2. 72 efg 3. 00 e 3. 35 efg 1 c 0. 85 cdef 2. 02 bc 2. 75 defg 3. 00 e 3. 18 h 2 a 0. 87 cde 2. 19 a 2. 76 def 3. 00 e 3. 18 h 2 c 0. 79 fg 1. 68 g 2. 77 cdef 3. 25 c 3. 57 cd 4 c 0. 84 cdef 1. 85 ef 2. 85 bcde 3. 00 e 3. 42 ef 5 a 0. 61 i 1. 75 fg 2. 86 bcde 3. 17 d 3. 00 i 6 a 0. 82 defg 2. 04 b 2. 88 bcde 3. 00 e 3. 35 fg 6 c 8 b 8 c c 19 0. 88 c 0. 98 b 0. 87 cd 1. 11 a 2. 00 bcd 2. 05 b 1. 91 cde 2. 13 ab 2. 95 bcd 2. 98 bc 3. 00 ab 3. 21 a 3. 00 e 3. 32 a 3. 00 e 3. 47 de 3. 00 i 3. 82 a 3. 00 i 4. 5 4 10 a 10 b 11 b 3. 5 12 a 14 a 3 Centímetros (cm) Cepas 14 c 16 a 2. 5 18 b 1 c 2 2 a 2 c 1. 5 4 c 5 a 6 a 1 6 c 8 b 0. 5 8 c c 19 0 48 h 72 h 96 h Horas (H) 120 h 192 h

Prueba de Dunca para crecimiento diametral promedio de la interacción de las cepas de Trichodema spp con 6 Botricidas (en centímetros) en las pruebas de sensibilidad a las 48, 72, 96, 120 y 192 horas. IASA-Rumiñahui, Pichincha. 2010 Botricidas Teldor Stroby Cantus Thiofin Advance Ad+Str 48 h 0. 00 2. 23 2. 67 0. 00 c b a c c c 72 h 0. 00 5. 10 6. 12 0. 00 c b a c c c 96 h 0. 20 7. 50 8. 91 0. 00 c b a d d d 120 h 0. 44 9. 00 0. 00 b a a c c c 192 h 1. 89 9. 00 0. 03 0. 00 10 Centímetros (cm) 8 Teldor 6 Stroby Cantus 4 Thiofin 2 Advance Ad+Str 0 48 h -2 72 h 96 h Horas (H) 120 h 192 h b a a c c c

Crecimiento diametral de Trichoderma sp cepa 10 B en medio PDA con botricidas, a) Thiofin (B 4), b) Teldor (B 1), c) Cantus (B 3), d) Stroby (B 2), e) Avance (B 5), f) Avance más Stroby (B 6). IASA-Rumiñahui, Pichincha. 2010

Formulación y caracterización de Trichoderma sp. • • Cepa 10 B corresponde a Trichoderma atroviridae Colonia: crecimiento rápido, conidiciación apariencia granular o formando costras con la edad. Rápidamente se torna de color verde oscuro, reverso incoloro. • • Cepa C 19 corresponde a Trichoderma citrinoviridae Colonia: crecimiento rápido, conidiciación concéntrica de color verde claro, reverso ligeramente amarillento. Conidioforos alargados, hialinos.

Fase de Campo Porcentaje de Incidencia en campo de Botrytis cinerea en botones de tres variedades de Rosas Esquema de las Unidades experimentales en campo.

Análisis de varianza para el porcentaje de incidencia Botrytis cinerea sobre la variedades de rosas (Amelia, Freedom y Engagement), bajo el efecto dos tratamientos Cepa 10 B, Cepa C 19 y un químico (Testigo) finca Flor. Machachi, Cantón Mejía. Fuentes de Variación total tratamientos error (%) CV (%) Amelia GL Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 14 20. 00 ns 2 0. 00 16. 67 12 0. 00 34. 02 0. 00 Freedom Fuentes de Variación total GL Semana 1 Semana 2 Semana 3 14 tratamientos error (%) CV (%) 2 12 0. 00 0. 00 Semana 4 0. 00 Engagement Fuentes de Variación total tratamientos error (%) CV (%) GL Semana 1 14 2 12 Semana 2 0. 00 0. 00 Semana 3 0. 00 Semana 4 86. 67 ns 80 3. 33 26. 83

Media porcentual de incidencia de Botrytis cinerea en las variedades de rosa (Amelia, Freedom y Engagement) tratadas con dos productos Cepa 10 B, Cepa C 19 y un químico (testigo) en tres variedades de Rosas. Flor. Machachi-Machachi, Pichincha. 2010 Incidencia Variedad Amelia Tratamiento Semana 1 Semana 2 Semana 3 T 1 Cepa 10 B 0. 00 Semana 4 12 T 2 Cepa C 19 0. 00 14 T 3 Químico 0. 00 10 0. 00 Porcenaje (%) Amelia (%) Freedom (%) Semana 1 Semana 2 Semana 3 T 1 Cepa 10 B 0. 00 Semana 4 0. 00 T 2 Cepa C 19 0. 00 T 3 Químico 0. 00 Engagement (%) Tratamiento T 1 Cepa 10 B Semana 1 0. 00 Semana 2 0. 00 Semana 3 Semana 4 0. 00 38. 00 T 2 Cepa C 19 0. 00 32. 00 T 3 Químico 0. 00 30. 00 T 1 Cepa 10 B T 2 Cepa C 19 T 3 Químico 1 2 Semanas 3 4 Incidencia Variedad Engagement Porcentaje (%) Tratamiento 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 -5 T 1 Cepa 10 B T 2 Cepa C 19 T 3 Químico 1 2 Semanas 3 4

Análisis combinado. Tratamientos por variedad Análisis combinado para incidencia de Botrytis cinerea en tres variedades de rosas (Amelia, Freedom y Engagement) al tratrlas con dos productos Cepa 10 B, Cepa C 19 y un químico (testigo). Flor. Machachi-Machachi, Pichincha. 2010 Fuentes de Variación TOTAL VARIEDAD R/VAR TRATAMIENTO S V x T ERROR (%) CV (%) GL 44 2 12 2 4 24 Semana 1 0. 00 Semana 2 0. 00 0. 00 Semana 3 Semana 4 0. 00 4275. 56 ** 0. 00 20. 00 42. 22 ns 0. 00 32. 22 ns 0. 00 38. 33 0. 00 15. 11 0. 00 40. 97

Promedios para el porcentaje de incidencia de Botrytis cinerea en tres variedades de rosa (Amelia, Freedom y Engagemente) de acuerdo al análisis combinado del efecto de dos productos Cepa 10 B, Cepa C 19 y un químico. Flor. Machachi-Machachi, Pichincha. 2010 Semana 1 T 1 Cepa 10 B 0. 00 T 2 Cepa C 19 0. 00 T 3 Químico 0. 00 Porcentaje (%) Tratamiento Semana 2 Semana 3 40 35 30 25 20 15 10 5 0 -5 -10 Semana 4 12. 00 b 0. 00 a 33. 33 c T 1 Cepa 10 B T 2 Cepa C 19 T 3 Químico 1 2 Semanas 3 4

Escala de Severidad en campo de Botrytis cinerea en botones de tres variedades de Rosas Escala arbitraria empleada para las evaluaciones de severidad de Botrytis cinerea en poscosecha propuesta por Bravo y Castillo, (2005).

Análisis de varianza de Severidad de Botrytis cinerea sobre tres variedades de rosas bajo el efecto dos tratamientos Cepa 10 B, Cepa C 19 y un químico (Testigo) finca Flor. Machachi. Cantón Mejía. Amelia Fuentes de Variación total tratamientos error CV (%) GL Semana 1 14 2 12 Semana 3 Semana 4 0. 00 1 0. 00 2 0. 00 Freedom Fuentes de Variación total tratamientos error CV (%) GL Semana 1 14 2 12 Semana 2 0. 00 1 0. 00 Semana 3 Semana 4 0. 00 1 0. 00 Engagement Fuentes de Variación total tratamientos error (%) CV (%) GL Semana 1 14 2 12 Semana 2 0. 00 1 0. 00 Semana 3 Semana 4 0. 00 1 0. 00 2 0. 00

Escala de Severidad de dos productos Cepa 10 B, Cepa C 19 y un químico (testigo) en tres variedades de Rosas. Flor. Machachi-Machachi, Pichincha. 2010 Amelia Semana 1 1 Semana 2 1 1 1 Semana 3 1 1 1 Semana 4 2 2 2 severidad (escala) Tratamiento T 1 Cepa 10 B T 2 Cepa C 19 T 3 Químico Severidad Variedad Amelia 3 2 1 T 1 Cepa 10 B 0 T 2 Cepa C 19 -1 1 Freedom Semana 1 1 Semana 2 1 1 1 Semana 3 1 1 1 Semana 4 1 1 1 Engagement Tratamiento T 1 Cepa 10 B T 2 Cepa C 19 T 3 Químico Semana 1 1 Semana 2 1 1 1 Semana 3 1 1 1 Semana 4 2 2 2 Severidad (escala) Tratamiento T 1 Cepa 10 B T 2 Cepa C 19 T 3 Químico 2 3 Semanas T 3 Químico 4 Severidad Variedad Engagement 3 2 1 0 -1 T 1 Cepa 10 B T 2 Cepa C 19 1 2 3 Semanas 4 T 3 Químico

Análisis combinado. Tratamientos por variedad Análisis combinado de la Severidad en tres variedades de Rosas en relación al efecto de dos productos Cepa 10 B, Cepa C 19 y un químico (testigo ). Flor. Machachi-Machachi, Pichincha. 2010 Fuentes de Variación TOTAL VARIEDAD R/VAR TRATAMIENTO S V x T ERROR (Escala) CV (%) GL 44 2 12 2 4 24 Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 0. 00 0. 00 5. 00 ns 0. 00 ns 1. 33 0. 00 Promedios de Severidad en el análisis combinado del efecto de dos productos Cepa 10 B, Cepa C 19 y un químico con relación a las variedades en estudio Tratamiento T 1 Cepa 10 B T 2 Cepa C 19 T 3 Químico Semana 1 1 1 Semana 2 1 1 Semana 3 1 1 1 Semana 4 2 1 2

Poscosecha Porcentaje de Incidencia en Poscosecha de Botrytis cinerea en botones de tres variedades de Rosas. • Se tomaron 50 tallos al azar por cada tratamiento • El porcentaje de incidencia se basó en la fórmula: Análisis de varianza de incidencia Botrytis cinerea sobre la variedades de rosas bajo el efecto dos tratamientos Cepa 10 B, Cepa C 19 y un químico (Testigo) en Poscosecha, finca Flor. Machachi, Cantón Mejía. Fuentes de Variación total tratamientos Error (%) CV (%) GL 14 2 12 Amelia Freedom Engagement 0. 47 ns 0. 57 2. 53 29. 71 0. 00 0. 87 ns 0. 27 3. 07 16. 84

Media porcentual de Incidencia de dos productos Cepa 10 B, Cepa C 19 y un químico (testigo) en tres variedades de Rosas. Flor. Machachi-Machachi, Pichincha. 2010 Tratamiento Amelia Freedom Engagement T 1 Cepa 10 B 2. 20 1. 00 2. 60 T 2 Cepa C 19 2. 80 1. 00 3. 20 T 3 Químico 2. 60 1. 00 3. 40

Escala de Severidad en Poscosecha de Botrytis cinerea en botones de tres variedades de Rosas Análisis de varianza de Severidad de Botrytis cinerea sobre la variedades de rosas bajo el efecto dos tratamientos Cepa 10 B, Cepa C 19 y un químico (Testigo) en Poscosecha, finca Flor. Machachi; Cantón Mejía. Fuentes de Variación total tratamientos Error (%) CV (%) GL 14 2 12 Amelia Freedom Engagement 0. 00 2. 00 0. 00 1. 00 0. 00 2. 00 0. 00

Tratamiento Amelia Freedom Engagement T 1 Cepa 10 B 2. 00 1. 00 2. 00 T 2 Cepa C 19 2. 00 1. 00 2. 00 T 3 Químico 2. 00 1. 00 2. 00 Escala de Severidad Efecto de dos productos Cepa 10 B, Cepa C 19 y un químico (testigo) en tres variedades de Rosas. Flor. Machachi, Pichincha. 2010 2. 5 2 1. 5 T 1 Cepa 10 B 1 T 2 Cepa C 19 0. 5 T 3 Químico 0 Amelia Freedom Engagement Cepas de Trichoderma spp.

Vida en Floreo Análisis de varianza para incidencia de Botrytis cinerea en tres variedades de rosa en la variable vida en florero. Flor. Machachi-Machachi, Pichincha. 2010 fuentes de variación total tratamiento variedad error Cv (%) X (%) GL 26 2 2 22 Incidencia (%) 64. 59** 1067. 27** 9. 6 28. 67 8. 75

Prueba Duncan al 5% para promedios generales de incidencia de Botrytis cinerea en tres variedades de rosa (Amelia, Freedom Engagement) sujetas a la vida en florero determinados por la aplicación; en campo, dos productos Cepa 10 B, Cepa C 19 y un químico (testigo). Flor. Machachi-Machachi, Pichincha. 2010 16 tratamientos 10 B C 19 Test % Incidencia 13. 78 b 10. 67 a 8. 44 a Porcentage (%) 14 12 10 10 B 8 C 19 6 Test 4 2 0 Cepas de Trichoderma spp.

Prueba Duncan al 5%, para el comportamiento de tres variedades de rosas (Amelia, Freedom, Engagement), de acuerdo a los promedios generales de la incidencia de Botrytis cinerea en evaluaciones de vida en florero. 25 % Incidencia 21. 78 c 0. 00 a 11. 11 b 20 Porcentaje (%) variedades Amelia Freedom Engagement 15 amelia 10 freedom 5 engagement 0 -5 Variedades

Número de tallos destinados para exportación, mercado nacional y aquellos considerados como no aptos para la venta Tallos/nave destinados para exportación, mercado nacional y aquellos no aptos para la venta % Flor Mercado Exportación Nacional 7378, 032 97, 80 165, 968 2, 20 18200, 16 99, 00 183, 84 1, 00 Tratamientos Cepa 10 B Variedad Amelia Freedom Cepa 10 B Cepa C 19 Engagement Amelia Freedom 5489, 464 7332, 77 18200, 16 97, 40 97, 20 99, 00 146, 536 211, 23 183, 84 2, 60 2, 80 1, 00 Cepa C 19 Engagement 5455, 65 96, 80 180, 35 3, 20 Testigo (químico) Amelia 7347, 856 97, 40 196, 144 2, 60 Testigo (químico) Freedom 18200, 16 99, 00 183, 84 1, 00 Testigo (químico) Engagement 5444, 38 96, 60 191, 62 3, 40

Análisis Económico Descripción del beneficio bruto, costo variable y beneficio neto de los tratamientos Cepa 10 B, Cepa C 19 y Testigo Químico con sus respectivas variedades Análisis de dominancia de los tratamientos, Cepa 10 B, Cepa C 19 y Testigo (Químico) Tratamientos Variedad Tratamientos Cepa 10 B Amelia Cepa 10 B Freedom Cepa 10 B Engagement Cepa C 19 Amelia Cepa C 19 Freedom Cepa C 19 Engagement Testigo (químico) Amelia Testigo (químico) Freedom Testigo (químico) Engagement B. bruto C. variables B. neto Variedad B. neto C. variables 1844, 508 5, 4464 1839, 0616 t 1 Cepa 10 B Freedom 4544, 5936 5, 4464 N/D 4550, 04 5, 4464 4544, 5936 Freedom 4544, 5936 5, 4464 N/D 1372, 366 5, 4464 1366, 9196 t 2 Cepa C 19 Testigo t 3 (químico) Freedom 4542, 98 7, 06 DOM 1833, 1925 5, 4464 1827, 7461 Amelia 1839, 0616 5, 4464 DOM 4550, 04 5, 4464 4544, 5936 t 4 Cepa 10 B Testigo t 5 (químico) Amelia 1829, 904 7, 06 DOM 1363, 9125 5, 4464 1358, 4661 t 6 Cepa C 19 Amelia 1827, 7461 5, 4464 DOM 1836, 964 7, 06 1829, 904 t 7 Cepa 10 B Engagement 1366, 9196 5, 4464 DOM 4550, 04 7, 06 4542, 98 Engagement 1358, 4661 5, 4464 DOM 1361, 095 7, 06 1354, 035 t 8 Cepa C 19 Testigo t 9 (químico) Engagement 1354, 035 7, 06 DOM

Conclusiones • Se aislaron 17 cepas de Trichoderma sp y 1 cepa de Botrytis cinerea originarias de la finca Flor. Machachi • Las 18 cepas de Trichoderma sp. (17 cepas nativas y 1 cepa proveniente del banco de hongos biocontroladores de IASA 1) almacenadas en aceite de vaselina, suelo y silica gel fueron refrescadas con gran éxito presentando características morfológicas similares a las cepas de origen • De las 17 cepas de Trichoderma sp. nativas, se seleccionó una cepa promisoria, siendo esta la cepa 10 B por mostrar características biocontroladoras, crecimiento y capacidad de conidiación in vitro, para el patógeno Botrytis cinerea, causante de la enfermedad Moho gris en el cultivo de Rosa

• Al evaluar el efecto de 6 Botricidas frente a Trichoderma se determinó que el Botricida que más afectó a las cepas por tener menor crecimiento diametral fueron B 4, B 5 y B 6 (Thiofin, Avance y Avance más Stroby respectivamente) y los que menos afectaron por tener mayor crecimiento diametral fueron B 2 y B 3 (Stroby y Cantus respectivamente) • Los tratamientos Cepa 10 B, Cepa C 19 y control químico no tuvieron efecto significativo; en la incidencia y severidad, para el control del patógeno Botrytis cinerea en campo

• En Poscosecha no se manifestó presencia de la enfermedad, en la variedad Freedom. • En Poscosecha Amelia y Engagement el grado de incidencia y severidad, no manifestó diferencias significativas entre los tratamientos Cepa 10 B, Cepa C 19 y el tratamiento químico. • En el ensayo Vida en Florero los tratamientos que mostraron menor porcentaje de la incidencia de la enfermedad fueron el Tratamiento C 19 y el químico (testigo) con relación al tratamiento 10 B

• En ningún caso existió flor no apta para la venta. • Los tratamientos Variedad Freedom + cepa 10 B y Variedad Freedom + cepa C 19 constituyeron la mejor alternativa económica durante el desarrollo de la investigación.

RECOMENDACIONES • Se recomienda utilizar medios de cultivos selectivos, como el medio TMS, para el aislamiento de Trichoderma spp. facilitando así su aislamiento, purificación e identificación del antagonista • Utilizar los métodos de crioconcervación propuestos en esta investigación para hongos antagonistas y formar un cepario que permitirá tener cepas puras y viables. • Se recomienda la utilización de Trichoderma que mostraron buenas características antagónicas, alta esporulación, hiperparasitismo y de multiplicación in vitro, para su producción masiva en la finca Flor. Machachi.

• Realizar aplicaciones en campo del antagonista Trichoderma sp como un complemento para el biocontrol del patógeno Botrytis cinerea , siendo el rango máximo de 3 semanas y utilizar productos químicos preventivos/sistémicos para mantener bajo el umbral esta enfermedad. • Repoblar Trichoderma sp. cuando se utilicen productos como Thiofin, Avance y Avance más Stroby. • Implementar en el plan de rotación de productos para el control de Botrytis cinerea cepas promisorias de Trichoderma spp. abaratando costos para el control de la enfermedad y representando un control aceptable en variedades resistentes a la enfermedad